三、蛋白質(zhì)分子量的測定 3.3 沉降法 沉降法又稱超速離心法。蛋白質(zhì)溶液在受到強大的離心力作用時，蛋白質(zhì)分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質(zhì)分子的大小、密度和分子形狀有關(guān)，江蘇蛋白純化系統(tǒng)，也與溶劑的密度和粘度有關(guān)。蛋白質(zhì)顆粒在離心場中的沉降速度用每單位時間內(nèi)顆粒下沉的距離來表示。 在離心場中，蛋白質(zhì)分子所受到的凈離心力（離心力減去浮力）與溶劑的摩擦力平衡時，每單位離心場強度的沉降速度稱為沉降系數(shù)（Sedimentation Coefficient）。國際上采用Svedberg單位作為沉降系數(shù)的單位，江蘇蛋白純化系統(tǒng)，用S表示，以紀(jì)念超速離心法的創(chuàng)始人，瑞典***的蛋白質(zhì)化學(xué)家T.Svedberg，江蘇蛋白純化系統(tǒng)。一個Svedberg單位（或直接稱一個S）為1×10—13s。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)大約在1×10—13～200×10—13s范圍內(nèi)，即1S～200S。江蘇蛋白純化系統(tǒng)

    蛋白質(zhì)純化方法-親和層析親和層析法包括特異性配體親和層析法以及通用性配體親和層析法。比較這兩種親和層析法。特異性配體親和層析法通常將復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)作為配體，它的結(jié)合力比較大河吸附選擇性比較強。而通用性配體親和層析法通常將簡單的小分子物質(zhì)作為配體，因此，它具有低廉的成本，吸附容量比較高，通過對吸附和脫附條件的改善能夠使得層析的分辨率提高。原理親和層析的原理類似于酶-底物，***-受體與抗原-抗體等特異性反應(yīng)的機理。有一定的親和力在每對反應(yīng)物之間。與在酶與底物的反應(yīng)中，只有特異的底物才可以結(jié)合一定的酶，使復(fù)合物產(chǎn)生相同。在親和層析中，只有特異的配體才可以和一定的生命大分子有親和力，并且使復(fù)合物產(chǎn)生。親和層析配體呈固相，而酶與底物的反應(yīng)底物呈液相是它們的不同點。事實上，親和層析是在含有活化基團(tuán)的基質(zhì)M上以共價鍵的方式固化具有識別能力的配體L，將固相載體制作成功而固化后的配體束縛特異物質(zhì)的能力依然保持。所以當(dāng)在小層析柱裝入固相載體，使得欲分離的樣品在該柱經(jīng)過。此時，樣品中對配體有親和力的物質(zhì)S就能夠通過結(jié)構(gòu)互補效應(yīng)、范德瓦爾力與靜電引力等作用在固相載體上吸附著。 專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)廠家報價

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4 樣品的進(jìn)一步分離純化 用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進(jìn)一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。 1. 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析（gel-filtration chromatography）又稱為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠（Sephadex）裝入一個柱子中，制成凝膠柱。這種凝膠顆粒具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不同類型凝膠的網(wǎng)孔大小不同。當(dāng)把蛋白質(zhì)混合樣品加到凝膠柱中時，比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可進(jìn)入網(wǎng)孔內(nèi)，而大于網(wǎng)孔的分子則不能進(jìn)入被排阻在凝膠顆粒之外。當(dāng)用洗脫液洗脫時，被排阻的分子量大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠之間的縫隙先被洗脫下來，而比網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可連續(xù)不斷地進(jìn)入網(wǎng)孔內(nèi)。這樣的小分子不但流經(jīng)的路程長，而且受到來自凝膠內(nèi)部的阻力也很大，所以蛋白質(zhì)越小，從柱子上洗脫下來所需時間越長。由于不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，進(jìn)入網(wǎng)孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脫所用體積及時間不同，從而達(dá)到分離的目的。

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.2 蛋白質(zhì)的抽提 通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結(jié)構(gòu)破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過程中，應(yīng)注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。 2.3蛋白質(zhì)粗制品的獲得 選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行的分離。常用的有下列幾種方法： 1. 等電點沉淀法 不同蛋白質(zhì)的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互分離。 2. 鹽析法 不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性。 3. 有機溶劑沉淀法 中性有機溶劑如乙醇、**，它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，進(jìn)而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質(zhì)。此外，有機溶劑會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質(zhì)變性，使用該法時，要注意在低溫下操作.

三、蛋白質(zhì)分子量的測定 3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量 蛋白質(zhì)在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子大小、所帶電荷的量以及分子形狀。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中加入了十二烷基***鈉（sodium dodecylsulfate,SDS）。SDS是一種陰離子去污劑，可使蛋白質(zhì)變性并解離成亞基。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品中加入SDS（一般加入量為0.1％）后，SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷，這些電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原來所帶的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異。所有結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的形狀近似于長的橢園棒，它們的短軸是恒定的，而長軸與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比。這樣，消除了蛋白質(zhì)之間原有的電荷和形狀的差異，電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。 進(jìn)行凝膠電泳時，常常用一種染料作前沿物質(zhì)，蛋白質(zhì)分子在電泳中的移動距離和前沿物質(zhì)移動的距離之比值稱為相對遷移率，相對遷移率和分子質(zhì)量的對數(shù)成直線關(guān)系。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)和其相對遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將未知蛋白質(zhì)在同樣條件下電泳，根據(jù)測得的樣品相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上便可查出其分子量。四川化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)***的選擇

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蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 分離純化蛋白質(zhì)的一般程序 2.1 材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 分離提純某一種蛋白質(zhì)時，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性。所以要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。常用的破碎組織細(xì)胞的方法有： 1. 機械破碎法 這種方法是利用機械力的剪切作用，使細(xì)胞破碎。常用設(shè)備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。 2. 滲透破碎法 這種方法是在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎。 3. 反復(fù)凍融法 生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。 4. 超聲波法 使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。江蘇蛋白純化系統(tǒng)

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