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中級——問題求助和不斷總結;高級——難題解答和經驗分享這三個階段,也學到了不少知識,積累了很多寶貴經驗,與大家一起分享下。免疫組化實驗為例從我接觸的很多本科生和研究生中發(fā)現(xiàn),他們的確是免疫組化“新手”,他們只注重如何做和**終的結果,但對為什么這樣做不太感興趣。他們常按照網上所說的方法,摸索好的抗體濃度和條件后做出很漂亮的染色結果后,他們就認為自己已經掌握了免疫組化方法了,結果不求上進,更換一種新抗體后或實驗出現(xiàn)異常結果后就很難做出來了。當然,免疫組化對于我來說,做過很多,但也不能說什么都會,只不過我做的多了,失敗多了和思考多了,可能比新手多了解一些其中的訣竅,拿來與大家進行分享。此外,我個人經驗不可能面面俱到,還需要更多有經驗的高手一起分享、糾正和補充。在這里,我需要感謝中華病理網、丁香通、小木蟲論壇給我很大的幫助,還有上海舜田生物技術人員老師給我實驗很多指導和幫助,讓我受益匪淺。免疫組化免疫個人感悟1、其實免疫組化,我個人感覺方法和操作都不是很難,關鍵是結果出現(xiàn)異常時該如何去解決?我認為首先需要掌握好免疫組化實驗的原理,知道每一個操作步驟的目的。江蘇四色免疫組化技術服務
我一般初次做一種新抗體,喜歡先用說明書建議的低濃度和高濃度做一次,然后決定是向高還是低方向摸索。一般先決定二抗的濃度(工作液就好辦了,直接滴加),重點摸索一抗的**適濃度。注意:免疫反應中存在前帶和后帶效應,這提示不是濃度越高,陽性率就越高,反之亦然。⑷重要原因排除之后,也不要忽視抗體的質量:原裝抗體一般比較穩(wěn)定,效果較好;而進口分裝次之;工作液可能要注意質量問題。3、同時,DAB的孵育時間可能要適當延長,在鏡下觀察,有時可延長至30min。但一般3-10min比較好,此時背景也較淺。否則,說明抗體濃度不合適。4、***,血清封閉時間也可相應縮短。一般10-30min,但這個時間可以調整,封閉主要是降低切片的總體背景著色。5、此外,細胞通透也不可忽視。許多戰(zhàn)友認為石蠟切片一般不需細胞通透,因為切片時可能已經把細胞切開了,但對于胞**白,建議還是通透一下,促進抗體等試劑充分進入參與反應。6、以上原因,都是針對實際中常見原因來進行分析的,前提是排除操作者的操作錯誤而引起陰性結果,這就需要新手還是要設置陽性對照以排除方法的問題。還有抗體稀釋液的pH值過低等其它原因的干擾??傊?,要想把免疫組化做好,可能每一個環(huán)節(jié)都很重要。
具體時間需要摸索,而濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度,切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下,然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。***,熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長,可能后有大量的游離熒光素殘留,需要注意配制時小包裝和并進行適當?shù)碾x心。6)復染目的是形成細胞輪廓,從而更好對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。7)封片為了長期保存,我們一般用緩沖甘油等封片,此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然后一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時為止;當發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時,則可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會產生氣泡。8)切片清洗為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當?shù)丶訌娗逑矗ㄑ娱L時間和增多次數(shù))尤為重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意:⑴單獨沖洗,防止交叉反應造成污染。⑵溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式;⑶沖洗的時間要足夠,才能徹底洗去結合的物質。⑷PBS的PH和離子強度的使用和要求。
【多色免疫組化染色樣本要求】1福爾馬林固定的蠟塊或玻片,大塊組織或TMA都可以,封蠟不能有明顯的破損。2玻片樣本,組織需要緊貼玻片,避免褶皺,玻片不能有破損、劃傷或污漬。3組織**小應包含大于1000個細胞。4蠟塊需包埋實體瘤組織,壞死瘤組織、細針穿刺物、細胞甩片樣品會影響染色效果。5組織應當用10%中性福爾馬林固定,正常固定時間為18~24小時。6切片厚度為4μm左右,使用防脫玻片。建議玻片在固定后一周內制備為佳。7不要在水浴撈片環(huán)節(jié)添加任何粘合劑,樣本應置于玻片正面、**。將撈片豎直置于吸水紙上去除水分,輕敲去除水滴,不要用紙擦拭玻片。8玻片置于45°C熱盤上放置30min(自然風干玻片時長不小于1小時)。【設備耗材】1檢驗所需設備器材:熒光顯微鏡、通風櫥、移液器、恒溫干燥箱、微波爐、計時器2檢測所需耗材器皿:免疫組化筆、微波修復杯、染色缸、孵育濕盒、蓋玻片、洗瓶、量筒100ml、量筒1000ml等【試劑制備】1通用試劑:DMSO、miejun去離子水、二甲苯、乙醇(全部、95%、70%)、10%中性福爾馬林、抗原修復液(推薦使用佰諾全景酸性或堿性抗原修復液)、一抗封閉液等。天津多標記免疫組化染色服務
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在肌肉、皮下、靜脈或腹腔內注射;·抗體效價的檢測:加強免疫一周后,耳緣靜脈**–抗體效價測定可用環(huán)狀沉淀試驗、瓊脂雙向擴散法等方法。前者抗體效價在1:4000以上,后者在1:16以上,即可**,取血清進一步提純。舉例2:微量抗原淋巴結內注射免疫家兔·一般選擇~–先在其兩腳墊注射完全福氏佐劑(卡介苗每兔合5mg);–10天后,見胭窩淋巴結腫大,然后將抗原注射至腫大的淋巴結內,***次注射抗原用完全福氏佐劑混合乳化;–以后每隔20天用不完全福氏佐劑乳化抗原,以同樣方法加強2次,各次注射的抗原均為25~50?g;–末次注射兩周后兔耳放血測價(可達1:128)。舉例3:豚鼠和大鼠的免疫·初次免疫–用10~100?gAg加入FCA,在背部皮內注射4~6點,每點,也可肌肉內或皮下注射;·加強免疫–每隔7~8天,將10~50?gAg于PBS或FIA中。在肌肉、皮下或靜脈注射;·抗體效價的檢測(4)免疫劑量·抗原性強的抗原量應小,過大反會引起免疫***;·免疫周期長的動物可少量多次注射,短的可大量少次。(4)免疫劑量(續(xù))·各種動物***免疫抗原劑量和加強免疫的劑量(5)抗體效價的檢測多采免疫雙向擴散法【基本原理】·指抗原和抗體在同一凝膠內都擴散,彼此相遇后形成特異性的沉淀線。江蘇四色免疫組化技術服務
上海朝瑞生物科技有限公司是一家1.發(fā)布科研技術 2.發(fā)布應用技術 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務 8.發(fā)布升級改造產品服務 9.發(fā)布實驗室及儀器設備共享 10.發(fā)布培訓基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務 15.發(fā)布資源交換業(yè)務的公司,是一家擁有雇員人數(shù)優(yōu)異員工的企業(yè)。公司自成立以來,以質量為發(fā)展,讓匠心彌散在每個細節(jié),公司旗下[ "科研技術服務", "應用技術服務", "科研成果轉化", "科學產品銷售" ]深受客戶的喜愛。公司將不斷增強企業(yè)重點競爭力,努力學習行業(yè)先進知識,遵守行業(yè)規(guī)范,植根于化工行業(yè)的發(fā)展。公司憑借創(chuàng)新的產品、專業(yè)的服務、眾多的成功案例積累起來的聲譽和口碑,讓企業(yè)發(fā)展再上新高。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/1000289.html
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