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產(chǎn)品關鍵詞:江蘇多標記免疫組化檢測服務,免疫組化
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TSA技術(Tyramide Signal Amplification?,酪胺信號放大技術)是做多重免疫熒光染色的一種多快好省的方法,江蘇多標記免疫組化檢測服務,江蘇多標記免疫組化檢測服務,江蘇多標記免疫組化檢測服務,它使同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體,搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗,而且信號放大的倍數(shù)**增強。如果想要運用這個技術,需要先做四個方面的準備工作:嚴格驗證的高特異性抗體:所有CST的IHC-P驗證過的抗體都滿足mIHC(多重熒光免疫組化)高特異性的要求;HRP偶聯(lián)的針對一抗種屬亞型特異的二抗;酪胺熒光素(Perkin Elmer,Thermo Fisher Scientific等供應商);多光譜成像系統(tǒng)(PerkinElmer等)。江蘇多標記免疫組化檢測服務
多重熒光免疫組化染色技術
免疫組化染色是一種研究組織形態(tài)和原位蛋白表達的常見技術,隨著免疫zhiliao的崛起,越來越多**微環(huán)境種的標志物被發(fā)現(xiàn)與疾病zhiliao、進展密切相關,對這些標志物進行同時染色標記、并研究它們之間的共定位、表達量和距離關系成為**免疫研究的普遍需求。
酪氨信號放大技術原理
類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色法,TSA(Tyramide signal amplification)技術同樣采用HRP標記的二抗,HRP催化加入體系的熒光素底物,生成活化熒光底物,活化底物可與抗原上的酪氨酸共價結合,使樣品上穩(wěn)定地共價結合熒光素。之后用熱修復洗去非共價結合的抗體,再換下一種一抗來第二輪孵育,換另一種熒光素底物,如此往復就可實現(xiàn)多重標記。
江蘇多標記免疫組化檢測服務
pH)漂洗5min×3/次,不時震蕩(洗去多余游離的熒光素標記的抗體)?!ぞ彌_甘油封片–分析純無熒光的甘油9份+pH,?!ょR檢:在熒光顯微鏡下觀察?!?yōu)點:方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少。·缺點:敏感性偏低;而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。若檢測多種抗原需制備多種相應的熒光標記抗體。?直接免疫熒光法的注意事項·對熒光標記的抗體的稀釋:要保證抗體的蛋白有一定的濃度;·一般稀釋度不應超過1:20,抗體濃度過低,會導致產(chǎn)生的熒光過弱,影響結果的觀察。?直接免疫熒光法的注意事項(續(xù))·染色溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化;–染色時間:從10min到數(shù)小時,一般30min;–染色溫度:多采用室溫(25?C),高于37?C可加強染色效果,但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎***)可采用0-2?C的低溫,延長染色時間。–低溫染色過夜較37?C30min效果好的多。?直接免疫熒光法的注意事項(續(xù))·試驗時需設置下列對照:–自發(fā)熒光對照(空白對照):標本加,。–陽性對照:用已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。–特異性對照(***試驗):標本加未標記的特異性抗體,再加熒光標記的特異性抗體。
在放入氨水中返蘭即可。13)封片為了長期保存,我們一般用中性樹膠等封片,避免產(chǎn)生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然后一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時為止;當發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時,則可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。2、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)1)冰凍切片制備建議用新鮮組織,否則組織細胞內(nèi)部結構破壞,易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等,防止裂片和脫片嚴重。2)組織切片固定切好片風干后立即用冰**等固定液進行固定5-10min,尤其要較長時間保存的白片,一定要及時固定和適當保存。3)血清封閉為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結合,需要在一抗孵育前先用血清(與二抗來源一致)封閉,減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調(diào)整的,一般10-30min。4)一抗孵育條件在免疫組化反應中**重要,包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種:4℃、室溫、37℃,其中4℃效果比較好;孵育時間:這與溫度、抗體濃度有關,一般37℃1-2h,而4℃過夜和從冰箱拿出后37℃復溫45min。具體條件還要摸索。5)二抗孵育條件二抗一般室溫或37℃30min-1h。
6、看來主要禍根是抗體稀釋液的pH值出問題了,于是我又用PBS替代抗體稀釋液和新試劑盒內(nèi)的試劑對組織切片做了免疫組化,結果還是沒有做出來:背景很深。這真把我搞慘了。難道還有什么原因嗎?通過仔細分析:一抗一定是結合上去了(老SP試劑盒結果很好),問題是二抗沒有結合上去也不對(因為***背景很深,這說明二抗可能也結合上去了),DAB孵育時間現(xiàn)在只用1、5min也是背景深而特異性染色淺,那我又懷疑封閉血清了。7、我做了兩張切片:一張用老試劑盒內(nèi)還剩下一點的血清而另一張用新試劑盒內(nèi)的封閉血清,其余試劑(二抗、SP)均用新試劑盒提供的,結果是前一張效果很好,而后一張能夠看到特異性染色,但背景太深,拍照效果不佳。看來封閉血清也是罪會禍首之一。結果分析顯示:抗體稀釋液的PH值偏低和封閉血清的失效導致了我的免疫組化結果的不佳,望大家在以后的組化實驗中也要注意這兩個不太引人注意的關鍵問題。慘痛的教訓,值得引以為鑒。案例二DAB染色后切片著色呈陰性結果背景:其實免疫組化在DAB染色后一般有四種情況:陽性染色效果很好、陰性染色、非特異性染色很深、陰陽臉(染色不均勻)。而陰性染色是許多初學者經(jīng)常遇到的頭疼問題。天津五色免疫組化檢測服務
江蘇多標記免疫組化檢測服務
我身邊有個研究生同學在我們實驗室初次涉入免疫組化,聽說步驟不難,跟我后面做了幾次之后,就自己開始做了,連續(xù)做了三次,結果均是陰性染色。很掃興,不知是什么原因導致的,后來我還是請教了上海舜田生物老師,她**提供給我我很大的幫助,解決問題的思路也逐步清晰。問題及其解答:免疫組化染色呈陰性結果的原因有哪些?1、抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯誤。不知抗體是進口的還是國產(chǎn)的工作液,怎么這么高稀釋度也沒能做出陽性結果?另外,不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結果,抗原抗體反應有前帶和后帶效應,必須摸索比較好濃度。2、抗原修復不全,對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位,以利于與抗體結合;建議微波修復用高火4次*6min試試。有人做過實驗,這是比較好的時間和次數(shù)。若不行,還可高壓修復。3、組織切片本身這種抗原含量低;4、血清封閉時間過長。5、DAB孵育時間過短。6、細胞通透不全,抗體未能充分進入胞內(nèi)參與反應。7、開始做免疫組化,我建議你一定要首先做個陽性對照片,排除抗體等外的方法問題。我的實際解決方案:1、首先,排除組織切片內(nèi)的抗原有無丟失及其含量多少。免疫組化中兩個**重要的因素是抗原和抗體。江蘇多標記免疫組化檢測服務
上海朝瑞生物科技有限公司始建于2003-01-22,坐落于上海市松江區(qū)廣富林路697號昂立大廈2113室,現(xiàn)有員工5~10人余人。致力于創(chuàng)造***的產(chǎn)品與服務,以誠信、敬業(yè)、進取為宗旨,以建zrbiorise,SPRICELL,scienceladde產(chǎn)品為目標,努力打造成為同行業(yè)中具有影響力的企業(yè)。我公司擁有強大的技術實力,多年來一直專注于1.發(fā)布科研技術 2.發(fā)布應用技術 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務 9.發(fā)布實驗室及儀器設備共享 10.發(fā)布培訓基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務 15.發(fā)布資源交換業(yè)務的發(fā)展和創(chuàng)新,打造高指標產(chǎn)品和服務。自公司成立以來,一直秉承“以質(zhì)量求生存,以信譽求發(fā)展”的經(jīng)營理念,始終堅持以客戶的需求和滿意為重點,為客戶提供質(zhì)量的[ "科研技術服務", "應用技術服務", "科研成果轉化", "科學產(chǎn)品銷售" ],從而使公司不斷發(fā)展壯大。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/1018380.html
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