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詳細說明
如淋巴細胞表面抗原尤其適合。·組織凍結過程中,細胞內、外的水分會形成冰晶,凍結的速度愈慢,冰晶顆粒愈大,可嚴重影響組織、細胞的形態(tài)結構。因此制備凍塊時要求低溫、速凍。1、冰凍組織塊的常用方法·液氮中冰凍:組織投入液氮中(一196?C)中10~20sec;·干冰中加入**(或異戊烷),液體立即氣化起泡,溫度降至一70?C,將組織投入,若在干冰**中置一盛有異戊烷的容器,組織投入該容器內結凍則更好;–上述組織在速凍時應浸埋于OCT包埋劑或甲基纖維素糊狀液內,以保護組織。–制成凍塊后若需保存,應以鋁箔或塑料薄膜封包,貯存于-70?C冰箱。2、切片·供免疫組化用的冰凍切片同樣要求附貼平整,并有連續(xù)性?!ぽd玻片也應清潔無油污,但一般無需涂抹粘附劑;·切片時,使用恒溫冷凍切片機,在箱內溫度-25?C。切片厚度一般為4~8?m。3,上海多標記免疫組化技術服務、切片后處理·切好的冰凍切片,室溫下自然晾干1~2h后,入4?C**固定10min,上海多標記免疫組化技術服務,待干燥后作免疫組化染色或封存于-20℃。·冰凍切片由于切片技術要求較高,不易得到連續(xù)性很好的切片,其形態(tài)結構亦不如石蠟片,上海多標記免疫組化技術服務,且凍塊和切片不便于長期貯存,因此冰凍切片的應用受限。上海多標記免疫組化技術服務
近年來,隨著免疫組織化學技術的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn),使許多疑難**得到了明確診斷。在常規(guī)**病理診斷中,5%-10%的病例單靠H.E.染色難以作出明確的形態(tài)學診斷。尤其是免疫組化在**診斷和鑒別診斷中的實用價值受到了普遍的認可,其在低分化或未分化**的鑒別診斷時,準確率可達50%-75%。免疫組織化學的臨床應用主要包括以下幾方面:⑴惡性**的診斷與鑒別診斷;⑵確定轉移性惡性**的原發(fā)部位;⑶對某類**進行進一步的病理分型;⑷軟組織**的zhiliao一般需根據(jù)正確的組織學分類,因其種類多、組織形態(tài)相像,有時難以區(qū)分其組織來源,應用多種標志進行免疫組化研究對軟組織**的診斷是不可缺少的;⑸發(fā)現(xiàn)微小轉移灶,有助于臨床zhiliao方案的確定,包括手術范圍的確定。⑹為臨床提供zhiliao方案的選擇。天津五色免疫組化檢測服務
1)動物的選擇選擇什么動物來免疫取決于:·所需抗血清的量–小鼠只能提供~,而山羊能提供幾升?!つ芄┟庖哂玫目乖卡C小鼠50μg足夠,而山羊需要幾毫克。(1)動物的選擇(續(xù))·動物的品系:免疫動物與提供抗原的動物之間的種系差異越大越好。–例如哺乳動物的抗原可選擇非哺乳動物來制備抗體。–常用的動物有兔、羊、馬、豬等,以兔(新西蘭兔,年輕,健壯,體重在,雄性)為**常用。(2)佐劑(adjuvant)·一般可溶性抗原注射后,迅速從注射部位擴散、吸收代謝。佐劑可延長滯留時間,且延長免疫刺激作用。因此在制備抗體的過程中,常將抗原和佐劑一起注射。·**常用的佐劑是弗氏佐劑,又分為:–弗氏不完全佐劑(Freund'sincompleteadjuvant)–弗氏完全佐劑(Freund'scompleteadjuvant)弗氏不完全佐劑(Freund'sincompleteadjuvant,FIA)·是由油劑(石蠟油或植物油)與乳化劑(羊毛脂或Tween80)混合而成,比例為1:1、2:1、3:1或5:1,可根據(jù)需要而定,通常2:1?!な褂脮r與水溶性抗原按1:1比例充分混合,使抗原分散在佐劑中形成油包水乳劑。弗氏完全佐劑(Freund'scompleteadjuvant,FCA)·在弗氏不完全佐劑中加入活卡介苗或死的結核分枝桿菌(終濃度為2~20mg/ml),即成為FCA。
時間過長,會使熒光減弱。·每次試驗時,需設置以下三種對照:–陽性對照:陽性血清+熒光標記物–陰性對照:陰性血清+熒光標記物–熒光標記物對照:PBS+熒光標記物?間接免疫熒光法的注意事項(續(xù))·標本片需在操作的各個步驟中,始終保持濕潤,避免干燥?!ひ豢购投箲冀K保持在標本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。免疫細胞化學技術免疫酶酶標法【原理】·以酶作為標記物與外加底物作用后產生不溶性色素,沉積于抗原和抗體反應的部位;·酶降解底物的量與色澤濃度成正比??煞从潮粶y定的抗原或抗體的量。1、常用的標記酶及其顯色底物·辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)及底物·堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)及底物(1)辣根過氧化物酶(HRP)及底物·HRP是應用**廣的一種酶,來源于植物辣根,由無色的酶蛋白和深棕色的鐵葉琳結合而成,分子量約40kDa,穩(wěn)定性好;·底物為過氧化物和供氫體(DH2)–過氧化物:常用過氧化氫和過氧化氫尿素。–供氫體:多用無色的還原型染料,通過反應生成有色的氧化型染料,**常用的供氫體是DAB。DAB(二氨基聯(lián)苯胺)·DAB本身無色,反應后呈棕色,不溶于水,不易褪色,電子密度高,**為常用。
6)滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體,室溫/37℃孵育30分鐘-1h,PBS/TBS沖洗,3分鐘×5次。7)應用DAB溶液顯色。8)蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明、封片。三、免疫熒光技術(略)1、酶免疫組化的關鍵環(huán)節(jié)1)標本固定固定的目的是①防止標本從玻片上脫落;②除去妨礙抗原-抗體結合的類脂,使抗原抗體結合物易于獲得良好的染色結果;③固定的標本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛,但睪丸組織、眼可能要選用Bouin’s液或mDF液效果較好。2)脫水、石蠟包埋和制片脫水用梯度乙醇(由低到高)充分脫水、對組織要完全浸蠟、切片時刀片要干凈和鋒利。否則,容易裂片和脫片等。3)脫蠟和水化這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結合反應。脫蠟可以先60℃20min,然后立即二甲苯1-3分別10min(這個時間是由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定的),但當天制好的切片一般先60℃3-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應和浸洗不全,而產生非特異性背景著色。4)抗原修復由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中,發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用,從而失去抗原性;通過抗原修復,使得細胞內抗原決定族重新暴露。天津五色免疫組化檢測服務
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文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/1049082.html
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