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詳細說明
Trizol法提取RNA實驗步驟及原理
1.在提取組織RNA時,每50~100mg組織用1mL Trizol試劑對組織進行裂解;提取細胞RNA時,先用PBS洗滌/離心沉淀細胞,江蘇四步完成RNA提取試劑盒信賴推薦,每5-10 ╳106個細胞加1mL Trizol后, 反復(fù)用吹打或劇烈振蕩以裂解細胞.
2、將組織或細胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,江蘇四步完成RNA提取試劑盒信賴推薦, 在室溫15~30℃下放置5分鐘;在EP管中,按照每1mL TRIZOL加0.2mL氯仿的量加入氯仿(即為1/5體積), 蓋上EP管蓋子, 在手中用力震蕩15秒(10次), 在室溫下(15℃~30℃)放置2~3分鐘后, 14000rpm(4℃)離心15分鐘.
【注:離心后分為3層,RNA在上層水相, DNA在中間層, 蛋白質(zhì)在下層有機相】
3,江蘇四步完成RNA提取試劑盒信賴推薦、取上層水相置于新EP管中(~500uL, 用200uL的黃色*頭小心吸取, 約吸取3次, 杜絕取到中間層/下層), 按照每1mL Trizol加0.5mL異丙醇的量加入異丙醇(即為1/2體積), 4℃下靜置20分鐘, 沉淀RNA;14000rpm(4℃)離心15分鐘.
4、按照每1mL TRIZOL加1mL75%乙醇進行洗滌(即為1倍體積, 注:用DEPC水配置75%乙醇), 混合(#用移液器輕輕吹打即可,不用將沉淀打碎), 14000rpm(4℃)離心20分鐘, 棄上清(#比較好用真空泵吸去上清);讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥(#或在超凈臺中小風(fēng)吹干,比較好置于干凈的環(huán)境中,防止灰塵雜質(zhì)進入);用45uL Rnase-free water 溶解RNA沉淀. 但是均存在價格高、訂貨周期長的問題(如果碰上國內(nèi)無貨的時候,要從國外發(fā)貨。江蘇四步完成RNA提取試劑盒信賴推薦
上海朝瑞生物科技有限公司是一家成立于2003年的****,總部坐落于上海。 公司自成立以來,秉承“真誠服務(wù)、合作雙贏”的經(jīng)營理念和良好的運作模式, 現(xiàn)已發(fā)展成為產(chǎn)品種類豐富、技術(shù)力量雄厚、配套設(shè)施齊全的前列生物技術(shù)企業(yè)。 我公司擁有良好的進貨渠道及國外采購合作伙伴, 能夠為您提供全球數(shù)百家公司的數(shù)百萬種產(chǎn)品的現(xiàn)貨及期貨訂購服務(wù)
產(chǎn)品主要應(yīng)用于分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細胞生物學(xué)、**、神經(jīng)生物學(xué)、干細胞、***等相關(guān)領(lǐng)域的生命科學(xué)研究以及***研發(fā)。同時,致力于生物技術(shù)***如單克隆抗體、重組蛋白***、***菌株、快速診斷等研究開發(fā)與技術(shù)服務(wù)。 上海9分鐘完成RNA提取試劑盒50T/690元離心收集細胞。每106動物、植物和酵母細胞或每107細菌細胞加1ml裂解液混勻。
. 樣品處理a. 植物組織:取新鮮或-70℃凍存100mg組織在液氮中研磨,把粉末加入到1ml裂解液中混勻。b. 動物組織:取新鮮或-70℃凍存100mg組織加1ml裂解液,用組織研磨杵或勻漿器勻漿處理。c. 貼壁細胞:直接在培養(yǎng)板中加入裂解液裂解細胞,每106細胞加1ml 裂解液。用取樣器吹打混勻。d. 細胞懸液:離心收集細胞。每106動物、植物和酵母細胞或每107細菌細胞加1ml裂解液混勻。e. 血液處理:取0.2-1ml新鮮血液加3倍體積紅細胞裂解液,混勻后室溫放置10分鐘, 10000rpm離心1分鐘。棄上清,若沉淀含有紅細胞,可加入2倍體積紅細胞裂解液重復(fù)裂解步驟。離心后沉淀加入1 ml裂解液混勻。
RNA 常用提取方法(1)
1、異硫氰酸胍氯化銫超速離心法:
原理:使用蛋白質(zhì)變性劑異硫氰酸胍有效制抑RN A 酶的活性,經(jīng)過起始密度為1.78g/m l 的氯化銫介質(zhì),進行密度梯度超速離心,RNA沉淀于管底,而DNA與蛋白質(zhì)在上清中。使用這種方法,不但能得到高質(zhì)量的RNA ,而且能同時分離出細胞染色體DNA。
2、鹽酸胍-有機溶劑法:
原理:本法有MacDonald1987年在Strohman報道的方法基礎(chǔ)上改進而成的,適用于沒有超速離心及設(shè)備的情況下提取細胞總RNA。它利用鹽酸胍制抑RNA酶,勻漿裂解細胞,有機溶劑抽提去除蛋白質(zhì),通過選擇性沉淀RNA分子而去除DNA。
3、氯化鋰-尿素法:
原理:本法首先由Auffray報道,利用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時制抑RNA酶,3 mol/L LiCl選擇性沉淀RNA。
當(dāng)前提取效果好的是RNA提取試劑盒,但其售價較高,單次實驗費用花費太大。
懸浮細胞:離心收集細胞,吸盡液體,每5×106-1×107 個細胞加入1ml Trizol, 再用移液器反復(fù)吹打?!咀ⅰ考尤?Trizol 前應(yīng)避免洗滌細胞,會增加 mRNA 降解的可能性。
c. 動、植物組織:取-80°C 凍存的組織在液氮中充分研磨后加入適量的Trizol混勻;或者取新鮮動物或植物組織盡量剪碎,然后加入適量的 Trizol 進行勻漿處理。
將勻漿樣品劇烈震蕩后在室溫條件下放置 5 分鐘以使**白體完全裂解?!咀ⅰ看瞬讲荒苁÷?,時間可以長于 5 分鐘。
(可選步驟)4°C,12000rpm 離心 10 分鐘,取上清?!咀ⅰ咳绻麡悠分泻休^多蛋白、脂肪、多糖等可離心除去。離心得到的沉淀中包括細胞外膜、多糖、高分子量的 DNA 等物質(zhì),上清中含有 RNA。處理脂肪組織樣品時,上層是大量油脂, 應(yīng)除去,然后再取澄清的勻漿溶液進行下一步的操作。 高度依賴進口,成本居高不下,這也導(dǎo)致我國大量基因檢測企業(yè)技術(shù)門檻低、盈利困難。江蘇四步完成RNA提取試劑盒信賴推薦
應(yīng)用場景快速延伸,**靶向診斷、病原體檢測、個體化用藥、**早篩等多個熱點方向得到了重點關(guān)注。江蘇四步完成RNA提取試劑盒信賴推薦
向勻漿樣品中加0.2ml氯仿,蓋好管蓋,劇烈振蕩15秒,室溫放置3-5分鐘。
2-8℃ 12000 rpm離心10分鐘。RNA主要在上層無色的水相中,把水相轉(zhuǎn)移到新管中,不要吸到沉淀。
吸附柱前處理:在吸附柱中加入500ul 洗柱液,室溫放置2分鐘,2-8℃ 12,000 rpm離心2min,棄廢液。
第4步收集的上清中加入200ul無水乙醇混勻,加入吸附柱靜置2分鐘,2-8℃ 12000rpm離心2min,棄廢液。
向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),2-8℃ 12,000 rpm離心2min,棄廢液。
向吸附柱中加入600ul漂洗液,2-8℃ 12,000 rpm離心2min,棄廢液。 江蘇四步完成RNA提取試劑盒信賴推薦
上海朝瑞生物科技有限公司創(chuàng)立于2003-01-22,總部位于上海市,是一家1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實驗室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù)的公司。公司自2003-01-22成立以來,投身于科研技術(shù)服務(wù),應(yīng)用技術(shù)服務(wù),科研成果轉(zhuǎn)化,科學(xué)產(chǎn)品銷售,是化工的主力軍。上海朝瑞科技始終以本分踏實的精神和必勝的信念,影響并帶動同事和團隊取得成功。上海朝瑞科技創(chuàng)始人仲緒軍,始終關(guān)注客戶,以優(yōu)化創(chuàng)新的科技,竭誠為客戶提供極好的服務(wù)。
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