轉(zhuǎn)膜(Transfer)

推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請(qǐng)參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。

通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，江蘇長(zhǎng)條帶Western Blot檢測(cè)分析服務(wù)，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，江蘇長(zhǎng)條帶Western Blot檢測(cè)分析服務(wù)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，比較好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，江蘇長(zhǎng)條帶Western Blot檢測(cè)分析服務(wù)，通常分子量比較大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液(P0017)對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。 江蘇長(zhǎng)條帶Western Blot檢測(cè)分析服務(wù)

(1) SDS-PAGE凝膠配制 

SDS-PAGE凝膠可以使用商業(yè)生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。

(2) 樣品處理：在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。 

(3) 上樣與電泳：冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。 為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，比較好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(P0066)。電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。 江蘇長(zhǎng)條帶Western Blot檢測(cè)分析服務(wù)

Western blotting堪稱蛋白質(zhì)研究中的經(jīng)典方法。學(xué)生物的幾乎無人不曉，即使沒親手做過，也清楚其原理。經(jīng)典果然是經(jīng)典，30年來其操作步驟幾乎沒變過，依然是跑膠-轉(zhuǎn)膜-封閉-孵育-檢測(cè)。近兩年，各大公司陸續(xù)推出了Western blotting方面的新儀器，如新型轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，確實(shí)能省時(shí)省力不少，但仍然不能完全克服研究人員在面臨的挑戰(zhàn)。Western

blotting仍存在重復(fù)性差、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、無法準(zhǔn)確定量等問題。

近日，美國(guó)proteinsimple公司推出了一種Simple Western?分析，徹底改變了整個(gè)Western blot。此分析在一臺(tái)名為Simon的儀器上開展，Simon將所有實(shí)驗(yàn)步驟自動(dòng)化，包括蛋白上樣和分離、免疫印跡、洗滌、檢測(cè)以及數(shù)據(jù)的定量分析，讓研究人員從繁重的勞動(dòng)中解放出來，同時(shí)避免了可能影響實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的人為因素。

收集蛋白樣品(Protein sample preparation)

可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，Western及IP細(xì)胞裂解液、RIPA裂解液等，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞**白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用Western及IP細(xì)胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒

    1.為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）?？乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰膪凝膠中從陰極向陽極泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）。2.電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1～2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。3.酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當(dāng)于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3，3，—二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍(lán)紫色）。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDS-PAGE時(shí)加人的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個(gè)有效的分析手段，不僅廣泛應(yīng)用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。在**中此法作為確診試驗(yàn)?？乖?jīng)電泳轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標(biāo)抗體及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實(shí)驗(yàn)室中供檢測(cè)用。 江蘇長(zhǎng)條帶Western Blot檢測(cè)分析服務(wù)

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目前，我國(guó)精細(xì)化工率在48%左右，與發(fā)達(dá)地區(qū)存在較大的差距，整個(gè)銷售行業(yè)處于成長(zhǎng)期，還有很大的發(fā)展空間。當(dāng)前，世界經(jīng)濟(jì)復(fù)蘇步伐艱難緩慢，全球市場(chǎng)需求總體偏弱，國(guó)際原油和大宗原料價(jià)格低迷，能源發(fā)展呈現(xiàn)新的特征。從戰(zhàn)略需求看，發(fā)展科研技術(shù)服務(wù)，應(yīng)用技術(shù)服務(wù)，科研成果轉(zhuǎn)化，科學(xué)產(chǎn)品銷售是必然選擇。在行業(yè)細(xì)分領(lǐng)域，我國(guó)有限責(zé)任公司產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶動(dòng)化工物流的需求。一方面，化工品大量進(jìn)出口需要專業(yè)化工跨境物流服務(wù)商提供服務(wù);一方面我國(guó)化工品的生產(chǎn)和消費(fèi)存在區(qū)域不平衡，使得國(guó)內(nèi)化工品運(yùn)輸需求較大。如今，1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長(zhǎng) 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗(yàn)檢測(cè)服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級(jí)改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實(shí)驗(yàn)室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項(xiàng)目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù)行業(yè)紛紛走向規(guī)?；?、智能化的道路。加上我國(guó)的產(chǎn)業(yè)政策，從環(huán)保的角度、從安全的角度，也要求生產(chǎn)方式從以前傳統(tǒng)的單體設(shè)備的生產(chǎn)，變成自動(dòng)化、清潔化的生產(chǎn)裝置。江蘇長(zhǎng)條帶Western Blot檢測(cè)分析服務(wù)

上海朝瑞生物科技有限公司致力于化工，是一家服務(wù)型公司。公司業(yè)務(wù)分為科研技術(shù)服務(wù)，應(yīng)用技術(shù)服務(wù)，科研成果轉(zhuǎn)化，科學(xué)產(chǎn)品銷售等，目前不斷進(jìn)行創(chuàng)新和服務(wù)改進(jìn)，為客戶提供良好的產(chǎn)品和服務(wù)。公司注重以質(zhì)量為中心，以服務(wù)為理念，秉持誠(chéng)信為本的理念，打造化工良好品牌。上海朝瑞科技秉承“客戶為尊、服務(wù)為榮、創(chuàng)意為先、技術(shù)為實(shí)”的經(jīng)營(yíng)理念，全力打造公司的重點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)力。

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