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產(chǎn)品關鍵詞:北京磷酸化蛋白Western Blot檢測服務,western blot
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詳細說明
轉膜完畢后,立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液(P0023C)中,漂洗1-2分鐘,以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢后所有的步驟,一定要注意膜的保濕,避免膜的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。用微型臺式真空泵或滴管等吸盡封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳,可以4℃緩慢搖動孵育過夜?;蚋鼡?jù)抗體的說明選擇適當?shù)姆跤郎囟群蜁r間。微型臺式真空泵或滴管等吸盡洗滌液,北京磷酸化蛋白Western Blot檢測服務,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。 回收二抗。加入Western洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后,北京磷酸化蛋白Western Blot檢測服務,再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。使用
ECL化學發(fā)光試劑來檢測蛋白。壓片可以采用**的壓片暗盒進行,北京磷酸化蛋白Western Blot檢測服務。洗片時可以使用X光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機,可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進行手工洗片。X光片推薦選用柯達原裝的生物實驗**柯達X-OMAT BT膠片。 北京磷酸化蛋白Western Blot檢測服務
Western blotting堪稱蛋白質(zhì)研究中的經(jīng)典方法。學生物的幾乎無人不曉,即使沒親手做過,也清楚其原理。經(jīng)典果然是經(jīng)典,30年來其操作步驟幾乎沒變過,依然是跑膠-轉膜-封閉-孵育-檢測。近兩年,各大公司陸續(xù)推出了Western blotting方面的新儀器,如新型轉印系統(tǒng),確實能省時省力不少,但仍然不能完全克服研究人員在面臨的挑戰(zhàn)。Western
blotting仍存在重復性差、實驗耗時長、無法準確定量等問題。
近日,美國proteinsimple公司推出了一種Simple Western?分析,徹底改變了整個Western blot。此分析在一臺名為Simon的儀器上開展,Simon將所有實驗步驟自動化,包括蛋白上樣和分離、免疫印跡、洗滌、檢測以及數(shù)據(jù)的定量分析,讓研究人員從繁重的勞動中解放出來,同時避免了可能影響實驗重復性的人為因素。 上海常規(guī)蛋白Western Blot檢測分析服務
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以使用商業(yè)生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。
(2) 樣品處理:在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關文獻資料配制100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白。
(3) 上樣與電泳:冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。 為了便于觀察電泳效果和轉膜效果,以及判斷蛋白分子量大小,比較好使用預染蛋白質(zhì)分子量標準(P0066)。電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳,而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置或類似電泳裝置,低電壓可以設置在80-100V,高電壓可以設置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳,或者可以根據(jù)預染蛋白質(zhì)分子量標準的電泳情況,預計目的蛋白已經(jīng)被適當分離后即可停止電泳。
轉膜(Transfer)
推薦在Western實驗中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用,但硝酸纖維素膜比較脆,在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。
通常如果使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置,可以設定轉膜電流為300-400mA,轉膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉膜過夜。具體的轉膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉膜時間越長,目的蛋白的分子量越小,需要的轉膜時間越短。在轉膜過程中,特別是高電流快速轉膜時,通常會有非常嚴重的發(fā)熱現(xiàn)象,比較好把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。
轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質(zhì)分子量標準,通常分子量比較大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進行染色,以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液(P0017)對完成轉膜的SDS-PAGE膠進行染色,以觀察蛋白的殘留情況。
1.為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)??乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶陰電荷,在聚丙烯酰膪凝膠中從陰極向陽極泳動,分子量越小,泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶)。2.電轉移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上,選用低電壓(100V)和大電流(1~2A),通電45min轉移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。3.酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜(相當于包被了抗原的固相載體)依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后,加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物,使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3,3,—二氨基聯(lián)苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈藍紫色)。陽性反應的條帶清晰可辨,并可根據(jù)SDS-PAGE時加人的分子量標準,確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的辨力和ELISA法的高特異性和敏感性,是一個有效的分析手段,不僅廣泛應用于分析抗原組分及其免疫活性,并可用于疾病的診斷。在**中此法作為確診試驗??乖?jīng)電泳轉移在硝酸纖維素膜上后,將膜切成小條,配合酶標抗體及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實驗室中供檢測用。 北京磷酸化蛋白Western Blot檢測服務
北京磷酸化蛋白Western Blot檢測服務
目前,我國精細化工率在48%左右,與發(fā)達地區(qū)存在較大的差距,整個銷售行業(yè)處于成長期,還有很大的發(fā)展空間。作為科研技術服務,應用技術服務,科研成果轉化,科學產(chǎn)品銷售的重要組成部分,防銹顏料發(fā)揮著減緩金屬腐蝕的效果,常見的含重金屬的防銹顏料雖然性能優(yōu)異,但對環(huán)境會造成極大污染,因而在實際使用中逐漸受到限制?;の锪餍袠I(yè)作為細分領域,除了與現(xiàn)代有限責任公司企業(yè)發(fā)展趨勢趨同以外,還與化工行業(yè)的發(fā)展情況密切相關,化工行業(yè)的良好發(fā)展為化工物流行業(yè)的發(fā)展奠定堅實的基礎。不少行業(yè)行家對智能制造的意義所在進行了定義?!耙话銇碚f,一個行業(yè)的工業(yè)發(fā)展軌跡,普遍都會遵循一個規(guī)律:那就是沿著手工-機械化-電氣化-自動化-信息化-智能制造這樣的道路來發(fā)展?!?。目前,國內(nèi)的1.發(fā)布科研技術 2.發(fā)布應用技術 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務 9.發(fā)布實驗室及儀器設備共享 10.發(fā)布培訓基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務 15.發(fā)布資源交換業(yè)務產(chǎn)制造行業(yè)同樣是在沿著這個軌跡發(fā)展的。北京磷酸化蛋白Western Blot檢測服務
上海朝瑞生物科技有限公司總部位于上海市松江區(qū)廣富林路697號昂立大廈2113室,是一家1.發(fā)布科研技術 2.發(fā)布應用技術 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務 9.發(fā)布實驗室及儀器設備共享 10.發(fā)布培訓基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務 15.發(fā)布資源交換業(yè)務的公司。上海朝瑞科技擁有一支經(jīng)驗豐富、技術創(chuàng)新的專業(yè)研發(fā)團隊,以高度的專注和執(zhí)著為客戶提供科研技術服務,應用技術服務,科研成果轉化,科學產(chǎn)品銷售。上海朝瑞科技不斷開拓創(chuàng)新,追求出色,以技術為先導,以產(chǎn)品為平臺,以應用為重點,以服務為保證,不斷為客戶創(chuàng)造更高價值,提供更優(yōu)服務。上海朝瑞科技始終關注化工市場,以敏銳的市場洞察力,實現(xiàn)與客戶的成長共贏。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/1201657.html
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