蛋白質分離純化步驟（二） 2，北京蛋白純化系統(tǒng).2 蛋白質的抽提 通常選擇適當?shù)木彌_液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據(jù)欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，北京蛋白純化系統(tǒng)，利于蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。 2.3蛋白質粗制品的獲得 選用適當?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|與其它雜蛋白分離開來，北京蛋白純化系統(tǒng)。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法： 1. 等電點沉淀法 不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互分離。 2. 鹽析法 不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質，并能再度溶解而不變性。 3. 有機溶劑沉淀法 中性有機溶劑如乙醇、**，它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作.北京蛋白純化系統(tǒng)

蛋白質分離純化步驟（二） 2.4.2 纖維素柱層析法 該法是利用蛋白質的酸堿性質作為分離的基礎。離子交換纖維素（cellulose ion-exchanger）是人工合成的纖維素衍生物，它具有松散的親水性網(wǎng)狀結構，有較大的表面積，使蛋白質大分子可以自由通過。因此常用于蛋白質的分離。 （1）羧甲基纖維素（CM-纖維素） 在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團。在中性pH條件下，羧甲基上的質子可解離下來（圖2-27a），而溶液中帶正電荷的蛋白質分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負電荷結合。可交換的基團帶正電，因此是一種陽離子交換劑。蛋白質與離子交換纖維素之間結合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團之間靜電吸引。 (2）二乙氨基乙基纖維素（DEAE-纖維素） 在中性pH條件下，它含有帶正電荷的基團，可與溶液中的帶負電荷的蛋白質結合，可交換的基團帶負電荷，因此是一種陰離子交換劑。當某一蛋白質混合溶液通過裝有DEAE-纖維素的層析柱時，帶正電荷的蛋白質不能結合而隨著洗脫液的流動先被洗脫下來。帶負電荷的蛋白質將被結合到柱上。結合力取決于彼此相反電荷基團間的靜電吸引。然后選用一定pH和離子強度的緩沖液進行洗脫，改變蛋白質分子所帶的靜電荷，依次從層析柱流出達到相互分離的目的。北京蛋白純化系統(tǒng)

實驗室及中試放大規(guī)模蛋白純化系統(tǒng) Unique Autopure系列蛋白純化系統(tǒng) 主要應用領域 ： – 蛋白純化系統(tǒng)主要應用于單抗、重組蛋白、疫苗、生化 藥、、天然產物和多糖等生物制藥領域。用于生物制品的下游工藝的分離純化。 Unique AutoPure 系列蛋白純化系統(tǒng) ： 產品特點及優(yōu)勢： – 模塊化設計，提供多個配置，滿足特殊工藝流程需求 - 低脈動高精度雙柱塞輸液泵 ，保證優(yōu)異的分離重現(xiàn)性 ; – 全系統(tǒng)與液體接觸的地方均由生物兼容性材料組成、符合FDA、USP VI等相關法規(guī)要求 ; – DAD全譜直讀檢測器，避免了傳統(tǒng)的機械切換式檢測器所帶來的不穩(wěn)定性及高故障率 ; – 固定波長檢測器燈為長壽命LED燈，壽命大于8000小時，降低維護成本 ; – **技術紫外檢測器流通池，低死體積、低峰拓展，提高了色譜分離度 ; – 高靈敏度在線pH、電導率、紫外檢測器，低死體積、低峰拓展，提高了色譜分離度 ; – 集中了buffer選擇閥，自動進樣閥、柱位閥等自動化組件，提高了純化的自動化程度 ; – 具有柱前、柱后、壓差報警，氣泡傳感器檢測等功能，極大的保護了系統(tǒng)及層析柱的安全性 ; – 層析工作站軟件是一款功能強大、性能先進、高穩(wěn)定性的色譜數(shù)據(jù)管理系

蛋白質分離純化步驟（二） 2.4 樣品的進一步分離純化 用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。 1. 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析（gel-filtration chromatography）又稱為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠（Sephadex）裝入一個柱子中，制成凝膠柱。這種凝膠顆粒具有網(wǎng)狀結構，不同類型凝膠的網(wǎng)孔大小不同。當把蛋白質混合樣品加到凝膠柱中時，比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質可進入網(wǎng)孔內，而大于網(wǎng)孔的分子則不能進入被排阻在凝膠顆粒之外。當用洗脫液洗脫時，被排阻的分子量大的蛋白質直接通過凝膠之間的縫隙先被洗脫下來，而比網(wǎng)孔小的蛋白質可連續(xù)不斷地進入網(wǎng)孔內。這樣的小分子不但流經的路程長，而且受到來自凝膠內部的阻力也很大，所以蛋白質越小，從柱子上洗脫下來所需時間越長。由于不同蛋白質的分子大小不同，進入網(wǎng)孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脫所用體積及時間不同，從而達到分離的目的。

三、蛋白質分子量的測定 3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量 蛋白質在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質分子大小、所帶電荷的量以及分子形狀。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中加入了十二烷基***鈉（sodium dodecylsulfate,SDS）。SDS是一種陰離子去污劑，可使蛋白質變性并解離成亞基。當?shù)鞍踪|樣品中加入SDS（一般加入量為0.1％）后，SDS與蛋白質分子結合，使蛋白質分子帶上大量的負電荷，這些電荷量遠遠超過蛋白質分子原來所帶的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質之間的電荷差異。所有結合SDS的蛋白質-SDS復合物的形狀近似于長的橢園棒，它們的短軸是恒定的，而長軸與蛋白質分子量的大小成正比。這樣，消除了蛋白質之間原有的電荷和形狀的差異，電泳的速度只取決于蛋白質分子量的大小。 進行凝膠電泳時，常常用一種染料作前沿物質，蛋白質分子在電泳中的移動距離和前沿物質移動的距離之比值稱為相對遷移率，相對遷移率和分子質量的對數(shù)成直線關系。以標準蛋白質分子質量的對數(shù)和其相對遷移率作圖，得到標準曲線。將未知蛋白質在同樣條件下電泳，根據(jù)測得的樣品相對遷移率，從標準曲線上便可查出其分子量。北京蛋白純化系統(tǒng)

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三、蛋白質分子量的測定 蛋白質分子量測定的方法很多，目前常用的方法有以下幾種。 3.1 凝膠過濾法 凝膠過濾法測定蛋白質分子量的原理如“分離純化方法”中所 述。一定型號的凝膠顆粒上具有一定大小的孔隙，只允許較小的分子進入膠粒，而大于孔隙的分子則不能進入膠粒而被排阻在膠粒外面。用洗脫液洗脫時，被排阻的分子量大的蛋白質先被洗脫下來，隨后能夠進入顆粒的蛋白質也按分子量大小而先后被洗脫下來，分子量越小的越后被洗脫下來。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質分子量范圍，在此范圍內，分子量的對數(shù)和洗脫體積之間成線性關系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質為標準進行層析分析，以每種蛋白質的洗脫體積對它們的分子量的對數(shù)作圖，繪制出標準洗脫曲線。未知蛋白質在同樣的條件下進行層析分析，根據(jù)其所用的洗脫體積，從標準洗脫曲線上可求出此未知蛋白質對應的分子量來。北京蛋白純化系統(tǒng)

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