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三、蛋白質分子量的測定 蛋白質分子量測定的方法很多,目前常用的方法有以下幾種。 3.1 凝膠過濾法 凝膠過濾法測定蛋白質分子量的原理如“分離純化方法”中所 述。一定型號的凝膠顆粒上具有一定大小的孔隙,樣品前處理專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門維修,只允許較小的分子進入膠粒,而大于孔隙的分子則不能進入膠粒而被排阻在膠粒外面。用洗脫液洗脫時,被排阻的分子量大的蛋白質先被洗脫下來,隨后能夠進入顆粒的蛋白質也按分子量大小而先后被洗脫下來,樣品前處理專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門維修,分子量越小的越后被洗脫下來。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質分子量范圍,在此范圍內,樣品前處理專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門維修,分子量的對數和洗脫體積之間成線性關系。因此,用幾種已知分子量的蛋白質為標準進行層析分析,以每種蛋白質的洗脫體積對它們的分子量的對數作圖,繪制出標準洗脫曲線。未知蛋白質在同樣的條件下進行層析分析,根據其所用的洗脫體積,從標準洗脫曲線上可求出此未知蛋白質對應的分子量來。樣品前處理專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門維修
蛋白質分離純化步驟(二) 2.2 蛋白質的抽提 通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑(十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等),使膜結構破壞,利于蛋白質與膜分離。在抽提過程中,應注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質的變性。 2.3蛋白質粗制品的獲得 選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法: 1. 等電點沉淀法 不同蛋白質的等電點不同,可用等電點沉淀法使它們相互分離。 2. 鹽析法 不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過調節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質,并能再度溶解而不變性。 3. 有機溶劑沉淀法 中性有機溶劑如乙醇、**,它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低,進而從溶液中沉淀出來,因此可用來沉淀蛋白質。此外,有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層,促使蛋白質分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質變性,使用該法時,要注意在低溫下操作.樣品前處理專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門維修
蛋白質分離純化步驟(二) 2.4.3. 親和層析 親和層析(affinity-chromatography)分離技術是根據許多蛋白質對特定的化學基團具有專一性結合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質所識別并與之結合的基團稱為配基或配體(ligand)。親和層析是一種極有效的分離純化蛋白質的方法。例如酶對它的底物具有特殊的親和力;抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A(concanavalin A)的分離純化為例,由于該蛋白對葡萄糖有專一性親和吸附,因此可把葡萄糖通過適當的化學反應共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質大分子與其配基的結合,在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂(或稱為間隔臂,spacerarm),使配體與載體之間保持足夠的距離。 將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱。當含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部,并沿柱從上往下過時,待純化的蛋白質與其特異性配基結合而被吸附到柱上,其他蛋白因不能與葡萄糖配基結合將通過柱子而流出(圖2-28a)。然后采用一定的洗脫條件,如濃的葡萄糖溶液進行洗脫,即可把該蛋白質洗脫下來,達到與其它蛋白質分離的目的。
三、蛋白質分子量的測定 3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量 蛋白質在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質分子大小、所帶電荷的量以及分子形狀。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中加入了十二烷基***鈉(sodium dodecylsulfate,SDS)。SDS是一種陰離子去污劑,可使蛋白質變性并解離成亞基。當蛋白質樣品中加入SDS(一般加入量為0.1%)后,SDS與蛋白質分子結合,使蛋白質分子帶上大量的負電荷,這些電荷量遠遠超過蛋白質分子原來所帶的電荷量,因而掩蓋了不同蛋白質之間的電荷差異。所有結合SDS的蛋白質-SDS復合物的形狀近似于長的橢園棒,它們的短軸是恒定的,而長軸與蛋白質分子量的大小成正比。這樣,消除了蛋白質之間原有的電荷和形狀的差異,電泳的速度只取決于蛋白質分子量的大小。 進行凝膠電泳時,常常用一種染料作前沿物質,蛋白質分子在電泳中的移動距離和前沿物質移動的距離之比值稱為相對遷移率,相對遷移率和分子質量的對數成直線關系。以標準蛋白質分子質量的對數和其相對遷移率作圖,得到標準曲線。將未知蛋白質在同樣條件下電泳,根據測得的樣品相對遷移率,從標準曲線上便可查出其分子量。
蛋白質分離純化步驟(二) 2.4.2 纖維素柱層析法 該法是利用蛋白質的酸堿性質作為分離的基礎。離子交換纖維素(cellulose ion-exchanger)是人工合成的纖維素衍生物,它具有松散的親水性網狀結構,有較大的表面積,使蛋白質大分子可以自由通過。因此常用于蛋白質的分離。 (1)羧甲基纖維素(CM-纖維素) 在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團。在中性pH條件下,羧甲基上的質子可解離下來(圖2-27a),而溶液中帶正電荷的蛋白質分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負電荷結合。可交換的基團帶正電,因此是一種陽離子交換劑。蛋白質與離子交換纖維素之間結合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團之間靜電吸引。 (2)二乙氨基乙基纖維素(DEAE-纖維素) 在中性pH條件下,它含有帶正電荷的基團,可與溶液中的帶負電荷的蛋白質結合,可交換的基團帶負電荷,因此是一種陰離子交換劑。當某一蛋白質混合溶液通過裝有DEAE-纖維素的層析柱時,帶正電荷的蛋白質不能結合而隨著洗脫液的流動先被洗脫下來。帶負電荷的蛋白質將被結合到柱上。結合力取決于彼此相反電荷基團間的靜電吸引。然后選用一定pH和離子強度的緩沖液進行洗脫,改變蛋白質分子所帶的靜電荷,依次從層析柱流出達到相互分離的目的。北京樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)***的選擇
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蛋白質分離純化步驟 蛋白質分離純化的一般原則: 大多數蛋白質在組織細胞中都是和核酸等生物分子結合在一起,而且每種類型的細胞都含有成千上萬種不同的蛋白質。許多蛋白質在結構、性質上有許多相似之處,所以蛋白質的分離提純是一項復雜的工作。到目前為止,還沒有一**成的方法能把任何一種蛋白質從復雜的混合物中提取出來。但是對于任何一種蛋白質都有可能選擇一種較合適的分離純化程序以獲得高純度的制品。且分離的關鍵步驟、基本手段還是共同的。 蛋白質提純的目的是增加產品的純度和產量,同時又要保持和提高產品的生物活性。因此,要分離純化某一種蛋白質,首先應選擇一種含目的蛋白質較豐富的材料。其次,應設法避免蛋白質變性,以制備有活性的蛋白質。對于大多數蛋白質來說,純化操作都是在0~4℃的低溫下進行的。同時也應避免過酸、過堿的條件以及劇烈的攪拌和振蕩。另外,還要設法除去變性的蛋白質和其它雜蛋白,從而達到增加純度和提高產量的目的。樣品前處理專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門維修
蘇州英賽斯智能科技有限公司是一家機器人與自動化設備、機械電子設備的研發(fā)、生產、銷售及技術咨詢;光學檢測設備、光電產品研發(fā)、制造、銷售;實驗室設備、儀器儀表的研發(fā)、制造、銷售及提供相關的技術咨詢和售后服務;自營和代理各類商品及技術的進出口業(yè)務(限定企業(yè)經營或禁止進出口的商品和技術除外)。(依法需經批準的項目,經相關部門批準后方可開展經營活動)的公司,是一家集研發(fā)、設計、生產和銷售為一體的專業(yè)化公司。英賽斯作為機器人與自動化設備、機械電子設備的研發(fā)、生產、銷售及技術咨詢;光學檢測設備、光電產品研發(fā)、制造、銷售;實驗室設備、儀器儀表的研發(fā)、制造、銷售及提供相關的技術咨詢和售后服務;自營和代理各類商品及技術的進出口業(yè)務(限定企業(yè)經營或禁止進出口的商品和技術除外)。(依法需經批準的項目,經相關部門批準后方可開展經營活動)的企業(yè)之一,為客戶提供良好的蛋白純化色譜系統(tǒng),凝膠凈化色譜系統(tǒng),制備液相色譜,柱塞泵。英賽斯繼續(xù)堅定不移地走高質量發(fā)展道路,既要實現基本面穩(wěn)定增長,又要聚焦關鍵領域,實現轉型再突破。英賽斯始終關注儀器儀表行業(yè)。滿足市場需求,提高產品價值,是我們前行的力量。
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