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產(chǎn)品關(guān)鍵詞:上海食品安全熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),熒光定量PCR
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詳細(xì)說(shuō)明
純度檢測(cè)
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,上海食品安全熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),比值范圍1.8到2.1。
變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定
制膠
1g瓊脂糖溶于72ml水中,冷卻至60℃,10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
灌制凝膠板,預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽內(nèi),上海食品安全熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。
準(zhǔn)備RNA樣品
取3μgRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
電泳
上樣前凝膠須預(yù)電泳5min,隨后將樣品加入上樣孔,上海食品安全熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)。5–6V/cm電壓下2h,電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2–3cm。
紫外透射光下觀察并拍照 上海食品安全熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
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上海食品安全熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
有關(guān)轉(zhuǎn)基因及其產(chǎn)品的安全性的爭(zhēng)論在國(guó)內(nèi)外愈演愈烈,各國(guó)**紛紛出臺(tái)一系列的政策、法規(guī),要求對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行標(biāo)識(shí),有些國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因的比較低含量做了限定,其閾值大小從1-5%不等。這就要求必須對(duì)轉(zhuǎn)基因及其產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)。 常規(guī)的檢測(cè)方法多采用PCR法,如PCR-凝膠電泳、PCR-ELISA等。這些方法普遍存在著PCR產(chǎn)物污染、特異性不高及速度慢等問題。熒光PCR技術(shù)是一種新近發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)技術(shù),它的應(yīng)用將從根本上解決這些問題。 1.收集了國(guó)內(nèi)外商品化的轉(zhuǎn)基因作物品種,并通過查閱有關(guān)文獻(xiàn)及網(wǎng)站初步確定了各種作物的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建圖; 2.于反應(yīng)體系中引入U(xiǎn)NG去污染酶,建立了無(wú)污染熒光PCR擴(kuò)增體系; 3.以植物內(nèi)源基因18SrRNA為靶標(biāo),設(shè)計(jì)了特異性引物和熒光探針,建立了以18SrRNA基因的擴(kuò)增與否來(lái)判斷核酸提取質(zhì)量好壞的方法; 4.以FAM熒光素為標(biāo)記,建立了以35S、NOS、NPTⅡ、Pat、Bar、FMV和CryⅢa為篩選目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物熒光PCR定性檢測(cè)體系; 5.分別以FAM和TET兩種熒光素標(biāo)記外源基因和內(nèi)源基因,建立了轉(zhuǎn)基因大豆及轉(zhuǎn)基因玉米的熒光定量PCR檢測(cè)體系。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中,通過不斷累積熒光信號(hào)從而使對(duì)PCR全程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn),再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板的方法,即是熒光定量PCR技術(shù)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中,實(shí)時(shí)檢測(cè)全程PCR擴(kuò)增過程,按照反應(yīng)時(shí)間和熒光信號(hào)的變化能夠?qū)⒁粭l曲線繪制成。混合模板DNA和有熒光素的Taqman探針,遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律使高溫變性,低溫復(fù)性,適溫延伸的熱循環(huán)完成,切斷和模板DNA互補(bǔ)配對(duì)的Taqman探針,熒光素在反應(yīng)體系中游離。熒光在特定光激發(fā)下發(fā)出,被擴(kuò)增的目的基因片段隨著循環(huán)次數(shù)的增加呈級(jí)增長(zhǎng),Ct值根據(jù)實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度求取出來(lái),同時(shí)對(duì)照多個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,就能夠使待測(cè)標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)得出。
溫度設(shè)置:在設(shè)置熒光 PCR 程序時(shí),要仔細(xì)核對(duì)程序中的目標(biāo)溫度、恒溫時(shí)間和循環(huán)次數(shù)等參數(shù),參數(shù)設(shè)置不正確將直接影響 PCR 檢測(cè)結(jié)果。延伸過程中要設(shè)置讀取收集熒光信號(hào),如不設(shè)置收集熒光,將無(wú)法保存試驗(yàn)數(shù)據(jù),無(wú)法判定檢測(cè)結(jié)果,造成試驗(yàn)失敗 操作規(guī)范:在對(duì)樣品進(jìn)行核酸提取和實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增時(shí)要規(guī)范操作,防止樣品的交叉污染、 酶的降解、假陽(yáng)性的出現(xiàn) 離心管、***頭和 PCR 管均需要高壓滅菌或使用商品化的無(wú) 污染的離心管、***頭和PCR 管。核酸提取結(jié)束后應(yīng)立即進(jìn)行儀器擴(kuò)增,提取的核酸不可長(zhǎng)時(shí)間置于室溫,易受空氣中酶的降解,短期可保存于 -20 ℃冰箱,長(zhǎng)期應(yīng)保存于-70 ℃冰箱 上海食品安全熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
上海食品安全熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
實(shí)時(shí)熒光定量常用Taqman探針法和SYBR Green I法兩類。
1.TaqMan探針法
TaqMan 探針法是具有高度特異性的定量PCR技術(shù)。它的工作原理為有一對(duì) PCR 引物和一條探針存在于PCR 反應(yīng)體系中,有熒光淬滅基團(tuán)存在于3′
端標(biāo)記,有報(bào)告基團(tuán)存在于探針的5′ 端標(biāo)記,探針*和模板特異結(jié)合,兩條引物之間是其結(jié)合點(diǎn)。因此信號(hào)儀器搜集不到,伴隨反應(yīng)的進(jìn)展,探針在外切核酸酶的活性的作用下被切斷,從而造成淬滅基團(tuán)不能吸收基團(tuán)的熒光能量,從而使熒光信號(hào)產(chǎn)生,所以模板 DNA 的拷貝數(shù)取決于信號(hào)的強(qiáng)度。
2.SYBR Green I法
SYBR Green I為一種具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料,其發(fā)射波長(zhǎng)比較大約為 520 nm,比較大吸收波長(zhǎng)約為 497 nm,能夠結(jié)合所有的雙螺旋小溝區(qū)域。由于處于游離狀態(tài),SYBR Green I發(fā)出的熒光較弱,然而其結(jié)合雙鏈 DNA之后,就會(huì)使得熒光**增強(qiáng),熒光信號(hào)的增加完全同步PCR 產(chǎn)物的增加。 上海食品安全熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
上海朝瑞生物科技有限公司致力于化工,是一家服務(wù)型的公司。公司業(yè)務(wù)涵蓋科研技術(shù)服務(wù),應(yīng)用技術(shù)服務(wù),科研成果轉(zhuǎn)化,科學(xué)產(chǎn)品銷售等,價(jià)格合理,品質(zhì)有保證。公司秉持誠(chéng)信為本的經(jīng)營(yíng)理念,在化工深耕多年,以技術(shù)為先導(dǎo),以自主產(chǎn)品為重點(diǎn),發(fā)揮人才優(yōu)勢(shì),打造化工良好品牌。上海朝瑞科技立足于全國(guó)市場(chǎng),依托強(qiáng)大的研發(fā)實(shí)力,融合前沿的技術(shù)理念,飛快響應(yīng)客戶的變化需求。
文章來(lái)源地址: http://www.cdcfah.com/cp/1344016.html
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