蛋白質(zhì)分離純化步驟 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則： 大多數(shù)蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞中都是和核酸等生物分子結(jié)合在一起，而且每種類型的細(xì)胞都含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì)。許多蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)上有許多相似之處，所以蛋白質(zhì)的分離提純是一項(xiàng)復(fù)雜的工作，樣品前處理直銷蛋白純化系統(tǒng)上門維修。到目前為止，還沒有一**成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中提取出來。但是對于任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一種較合適的分離純化程序以獲得高純度的制品。且分離的關(guān)鍵步驟、基本手段還是共同的。 蛋白質(zhì)提純的目的是增加產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量，同時又要保持和提高產(chǎn)品的生物活性，樣品前處理直銷蛋白純化系統(tǒng)上門維修。因此，要分離純化某一種蛋白質(zhì)，首先應(yīng)選擇一種含目的蛋白質(zhì)較豐富的材料。其次，樣品前處理直銷蛋白純化系統(tǒng)上門維修，應(yīng)設(shè)法避免蛋白質(zhì)變性，以制備有活性的蛋白質(zhì)。對于大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，純化操作都是在0～4℃的低溫下進(jìn)行的。同時也應(yīng)避免過酸、過堿的條件以及劇烈的攪拌和振蕩。另外，還要設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和其它雜蛋白，從而達(dá)到增加純度和提高產(chǎn)量的目的。樣品前處理直銷蛋白純化系統(tǒng)上門維修

實(shí)驗(yàn)室及中試放大規(guī)模蛋白純化系統(tǒng) Unique Autopure系列蛋白純化系統(tǒng) 主要應(yīng)用領(lǐng)域 ： – 蛋白純化系統(tǒng)主要應(yīng)用于單抗、重組蛋白、疫苗、生化 藥、、天然產(chǎn)物和多糖等生物制藥領(lǐng)域。用于生物制品的下游工藝的分離純化。 Unique AutoPure 系列蛋白純化系統(tǒng) ： 產(chǎn)品特點(diǎn)及優(yōu)勢： – 模塊化設(shè)計(jì)，提供多個配置，滿足特殊工藝流程需求 - 低脈動高精度雙柱塞輸液泵 ，保證優(yōu)異的分離重現(xiàn)性 ; – 全系統(tǒng)與液體接觸的地方均由生物兼容性材料組成、符合FDA、USP VI等相關(guān)法規(guī)要求 ; – DAD全譜直讀檢測器，避免了傳統(tǒng)的機(jī)械切換式檢測器所帶來的不穩(wěn)定性及高故障率 ; – 固定波長檢測器燈為長壽命LED燈，壽命大于8000小時，降低維護(hù)成本 ; – **技術(shù)紫外檢測器流通池，低死體積、低峰拓展，提高了色譜分離度 ; – 高靈敏度在線pH、電導(dǎo)率、紫外檢測器，低死體積、低峰拓展，提高了色譜分離度 ; – 集中了buffer選擇閥，自動進(jìn)樣閥、柱位閥等自動化組件，提高了純化的自動化程度 ; – 具有柱前、柱后、壓差報警，氣泡傳感器檢測等功能，極大的保護(hù)了系統(tǒng)及層析柱的安全性 ; – 層析工作站軟件是一款功能強(qiáng)大、性能先進(jìn)、高穩(wěn)定性的色譜數(shù)據(jù)管理系北京專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門維修

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4 樣品的進(jìn)一步分離純化 用等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進(jìn)一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。 1. 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析（gel-filtration chromatography）又稱為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠（Sephadex）裝入一個柱子中，制成凝膠柱。這種凝膠顆粒具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不同類型凝膠的網(wǎng)孔大小不同。當(dāng)把蛋白質(zhì)混合樣品加到凝膠柱中時，比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可進(jìn)入網(wǎng)孔內(nèi)，而大于網(wǎng)孔的分子則不能進(jìn)入被排阻在凝膠顆粒之外。當(dāng)用洗脫液洗脫時，被排阻的分子量大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠之間的縫隙先被洗脫下來，而比網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可連續(xù)不斷地進(jìn)入網(wǎng)孔內(nèi)。這樣的小分子不但流經(jīng)的路程長，而且受到來自凝膠內(nèi)部的阻力也很大，所以蛋白質(zhì)越小，從柱子上洗脫下來所需時間越長。由于不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，進(jìn)入網(wǎng)孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脫所用體積及時間不同，從而達(dá)到分離的目的。

三、蛋白質(zhì)分子量的測定 3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量 蛋白質(zhì)在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子大小、所帶電荷的量以及分子形狀。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中加入了十二烷基***鈉（sodium dodecylsulfate,SDS）。SDS是一種陰離子去污劑，可使蛋白質(zhì)變性并解離成亞基。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品中加入SDS（一般加入量為0.1％）后，SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷，這些電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原來所帶的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異。所有結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的形狀近似于長的橢園棒，它們的短軸是恒定的，而長軸與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比。這樣，消除了蛋白質(zhì)之間原有的電荷和形狀的差異，電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。 進(jìn)行凝膠電泳時，常常用一種染料作前沿物質(zhì)，蛋白質(zhì)分子在電泳中的移動距離和前沿物質(zhì)移動的距離之比值稱為相對遷移率，相對遷移率和分子質(zhì)量的對數(shù)成直線關(guān)系。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)和其相對遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將未知蛋白質(zhì)在同樣條件下電泳，根據(jù)測得的樣品相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上便可查出其分子量。

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4.2 纖維素柱層析法 該法是利用蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)作為分離的基礎(chǔ)。離子交換纖維素（cellulose ion-exchanger）是人工合成的纖維素衍生物，它具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積，使蛋白質(zhì)大分子可以自由通過。因此常用于蛋白質(zhì)的分離。 （1）羧甲基纖維素（CM-纖維素） 在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團(tuán)。在中性pH條件下，羧甲基上的質(zhì)子可解離下來（圖2-27a），而溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負(fù)電荷結(jié)合。可交換的基團(tuán)帶正電，因此是一種陽離子交換劑。蛋白質(zhì)與離子交換纖維素之間結(jié)合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團(tuán)之間靜電吸引。 (2）二乙氨基乙基纖維素（DEAE-纖維素） 在中性pH條件下，它含有帶正電荷的基團(tuán)，可與溶液中的帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，可交換的基團(tuán)帶負(fù)電荷，因此是一種陰離子交換劑。當(dāng)某一蛋白質(zhì)混合溶液通過裝有DEAE-纖維素的層析柱時，帶正電荷的蛋白質(zhì)不能結(jié)合而隨著洗脫液的流動先被洗脫下來。帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)將被結(jié)合到柱上。結(jié)合力取決于彼此相反電荷基團(tuán)間的靜電吸引。然后選用一定pH和離子強(qiáng)度的緩沖液進(jìn)行洗脫，改變蛋白質(zhì)分子所帶的靜電荷，依次從層析柱流出達(dá)到相互分離的目的。四川直銷蛋白純化系統(tǒng)***的選擇

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蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4.3. 親和層析 親和層析（affinity-chromatography）分離技術(shù)是根據(jù)許多蛋白質(zhì)對特定的化學(xué)基團(tuán)具有專一性結(jié)合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質(zhì)所識別并與之結(jié)合的基團(tuán)稱為配基或配體（ligand）。親和層析是一種極有效的分離純化蛋白質(zhì)的方法。例如酶對它的底物具有特殊的親和力；抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A（concanavalin A）的分離純化為例，由于該蛋白對葡萄糖有專一性親和吸附，因此可把葡萄糖通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質(zhì)大分子與其配基的結(jié)合，在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂（或稱為間隔臂，spacerarm），使配體與載體之間保持足夠的距離。 將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱。當(dāng)含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部，并沿柱從上往下過時，待純化的蛋白質(zhì)與其特異性配基結(jié)合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能與葡萄糖配基結(jié)合將通過柱子而流出（圖2-28a）。然后采用一定的洗脫條件，如濃的葡萄糖溶液進(jìn)行洗脫，即可把該蛋白質(zhì)洗脫下來，達(dá)到與其它蛋白質(zhì)分離的目的。樣品前處理直銷蛋白純化系統(tǒng)上門維修

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