蛋白質分離純化步驟（二） 2.4.3. 親和層析 親和層析（affinity-chromatography）分離技術是根據(jù)許多蛋白質對特定的化學基團具有專一性結合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質所識別并與之結合的基團稱為配基或配體（ligand），樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)廠家報價。親和層析是一種極有效的分離純化蛋白質的方法。例如酶對它的底物具有特殊的親和力；抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A（concanavalin A）的分離純化為例，由于該蛋白對葡萄糖有專一性親和吸附，因此可把葡萄糖通過適當?shù)幕瘜W反應共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質大分子與其配基的結合，在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂（或稱為間隔臂，spacerarm），使配體與載體之間保持足夠的距離。 將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱。當含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部，并沿柱從上往下過時，待純化的蛋白質與其特異性配基結合而被吸附到柱上，樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)廠家報價，其他蛋白因不能與葡萄糖配基結合將通過柱子而流出（圖2-28a）。然后采用一定的洗脫條件，如濃的葡萄糖溶液進行洗脫，樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)廠家報價，即可把該蛋白質洗脫下來，達到與其它蛋白質分離的目的。樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)廠家報價

    蛋白質純化方法-親和層析親和層析法包括特異性配體親和層析法以及通用性配體親和層析法。比較這兩種親和層析法。特異性配體親和層析法通常將復雜的生命大分子物質作為配體，它的結合力比較大河吸附選擇性比較強。而通用性配體親和層析法通常將簡單的小分子物質作為配體，因此，它具有低廉的成本，吸附容量比較高，通過對吸附和脫附條件的改善能夠使得層析的分辨率提高。原理親和層析的原理類似于酶-底物，***-受體與抗原-抗體等特異性反應的機理。有一定的親和力在每對反應物之間。與在酶與底物的反應中，只有特異的底物才可以結合一定的酶，使復合物產(chǎn)生相同。在親和層析中，只有特異的配體才可以和一定的生命大分子有親和力，并且使復合物產(chǎn)生。親和層析配體呈固相，而酶與底物的反應底物呈液相是它們的不同點。事實上，親和層析是在含有活化基團的基質M上以共價鍵的方式固化具有識別能力的配體L，將固相載體制作成功而固化后的配體束縛特異物質的能力依然保持。所以當在小層析柱裝入固相載體，使得欲分離的樣品在該柱經(jīng)過。此時，樣品中對配體有親和力的物質S就能夠通過結構互補效應、范德瓦爾力與靜電引力等作用在固相載體上吸附著。 樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)廠家報價

實驗室及中試放大規(guī)模蛋白純化系統(tǒng) Unique Autopure系列蛋白純化系統(tǒng) 主要應用領域 ： – 蛋白純化系統(tǒng)主要應用于單抗、重組蛋白、疫苗、生化 藥、、天然產(chǎn)物和多糖等生物制藥領域。用于生物制品的下游工藝的分離純化。 Unique AutoPure 系列蛋白純化系統(tǒng) ： 產(chǎn)品特點及優(yōu)勢： – 模塊化設計，提供多個配置，滿足特殊工藝流程需求 - 低脈動高精度雙柱塞輸液泵 ，保證優(yōu)異的分離重現(xiàn)性 ; – 全系統(tǒng)與液體接觸的地方均由生物兼容性材料組成、符合FDA、USP VI等相關法規(guī)要求 ; – DAD全譜直讀檢測器，避免了傳統(tǒng)的機械切換式檢測器所帶來的不穩(wěn)定性及高故障率 ; – 固定波長檢測器燈為長壽命LED燈，壽命大于8000小時，降低維護成本 ; – **技術紫外檢測器流通池，低死體積、低峰拓展，提高了色譜分離度 ; – 高靈敏度在線pH、電導率、紫外檢測器，低死體積、低峰拓展，提高了色譜分離度 ; – 集中了buffer選擇閥，自動進樣閥、柱位閥等自動化組件，提高了純化的自動化程度 ; – 具有柱前、柱后、壓差報警，氣泡傳感器檢測等功能，極大的保護了系統(tǒng)及層析柱的安全性 ; – 層析工作站軟件是一款功能強大、性能先進、高穩(wěn)定性的色譜數(shù)據(jù)管理系

蛋白質分離純化步驟（二） 2.2 蛋白質的抽提 通常選擇適當?shù)木彌_液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據(jù)欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利于蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。 2.3蛋白質粗制品的獲得 選用適當?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法： 1. 等電點沉淀法 不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互分離。 2. 鹽析法 不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質，并能再度溶解而不變性。 3. 有機溶劑沉淀法 中性有機溶劑如乙醇、**，它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作.

蛋白質分離純化步驟（二） 2.4 樣品的進一步分離純化 用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。 1. 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析（gel-filtration chromatography）又稱為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠（Sephadex）裝入一個柱子中，制成凝膠柱。這種凝膠顆粒具有網(wǎng)狀結構，不同類型凝膠的網(wǎng)孔大小不同。當把蛋白質混合樣品加到凝膠柱中時，比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質可進入網(wǎng)孔內(nèi)，而大于網(wǎng)孔的分子則不能進入被排阻在凝膠顆粒之外。當用洗脫液洗脫時，被排阻的分子量大的蛋白質直接通過凝膠之間的縫隙先被洗脫下來，而比網(wǎng)孔小的蛋白質可連續(xù)不斷地進入網(wǎng)孔內(nèi)。這樣的小分子不但流經(jīng)的路程長，而且受到來自凝膠內(nèi)部的阻力也很大，所以蛋白質越小，從柱子上洗脫下來所需時間越長。由于不同蛋白質的分子大小不同，進入網(wǎng)孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脫所用體積及時間不同，從而達到分離的目的。樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)廠家報價

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三、蛋白質分子量的測定 蛋白質分子量測定的方法很多，目前常用的方法有以下幾種。 3.1 凝膠過濾法 凝膠過濾法測定蛋白質分子量的原理如“分離純化方法”中所 述。一定型號的凝膠顆粒上具有一定大小的孔隙，只允許較小的分子進入膠粒，而大于孔隙的分子則不能進入膠粒而被排阻在膠粒外面。用洗脫液洗脫時，被排阻的分子量大的蛋白質先被洗脫下來，隨后能夠進入顆粒的蛋白質也按分子量大小而先后被洗脫下來，分子量越小的越后被洗脫下來。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質分子量范圍，在此范圍內(nèi)，分子量的對數(shù)和洗脫體積之間成線性關系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質為標準進行層析分析，以每種蛋白質的洗脫體積對它們的分子量的對數(shù)作圖，繪制出標準洗脫曲線。未知蛋白質在同樣的條件下進行層析分析，根據(jù)其所用的洗脫體積，從標準洗脫曲線上可求出此未知蛋白質對應的分子量來。樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)廠家報價

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