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蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.4.2 纖維素柱層析法 該法是利用蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)作為分離的基礎(chǔ)。離子交換纖維素(cellulose ion-exchanger)是人工合成的纖維素衍生物,它具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),有較大的表面積,使蛋白質(zhì)大分子可以自由通過(guò)。因此常用于蛋白質(zhì)的分離。 (1)羧甲基纖維素(CM-纖維素) 在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團(tuán)。在中性pH條件下,羧甲基上的質(zhì)子可解離下來(lái)(圖2-27a),而溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負(fù)電荷結(jié)合,四川化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)上門(mén)安裝。可交換的基團(tuán)帶正電,因此是一種陽(yáng)離子交換劑。蛋白質(zhì)與離子交換纖維素之間結(jié)合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團(tuán)之間靜電吸引。 (2)二乙氨基乙基纖維素(DEAE-纖維素) 在中性pH條件下,它含有帶正電荷的基團(tuán),四川化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)上門(mén)安裝,可與溶液中的帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合,四川化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)上門(mén)安裝,可交換的基團(tuán)帶負(fù)電荷,因此是一種陰離子交換劑。當(dāng)某一蛋白質(zhì)混合溶液通過(guò)裝有DEAE-纖維素的層析柱時(shí),帶正電荷的蛋白質(zhì)不能結(jié)合而隨著洗脫液的流動(dòng)先被洗脫下來(lái)。帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)將被結(jié)合到柱上。結(jié)合力取決于彼此相反電荷基團(tuán)間的靜電吸引。然后選用一定pH和離子強(qiáng)度的緩沖液進(jìn)行洗脫,改變蛋白質(zhì)分子所帶的靜電荷,依次從層析柱流出達(dá)到相互分離的目的。四川化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)上門(mén)安裝
蛋白質(zhì)分離純化步驟 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則: 大多數(shù)蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞中都是和核酸等生物分子結(jié)合在一起,而且每種類(lèi)型的細(xì)胞都含有成千上萬(wàn)種不同的蛋白質(zhì)。許多蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)上有許多相似之處,所以蛋白質(zhì)的分離提純是一項(xiàng)復(fù)雜的工作。到目前為止,還沒(méi)有一**成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中提取出來(lái)。但是對(duì)于任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一種較合適的分離純化程序以獲得高純度的制品。且分離的關(guān)鍵步驟、基本手段還是共同的。 蛋白質(zhì)提純的目的是增加產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量,同時(shí)又要保持和提高產(chǎn)品的生物活性。因此,要分離純化某一種蛋白質(zhì),首先應(yīng)選擇一種含目的蛋白質(zhì)較豐富的材料。其次,應(yīng)設(shè)法避免蛋白質(zhì)變性,以制備有活性的蛋白質(zhì)。對(duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō),純化操作都是在0~4℃的低溫下進(jìn)行的。同時(shí)也應(yīng)避免過(guò)酸、過(guò)堿的條件以及劇烈的攪拌和振蕩。另外,還要設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和其它雜蛋白,從而達(dá)到增加純度和提高產(chǎn)量的目的。樣品前處理樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)
實(shí)驗(yàn)室及中試放大規(guī)模蛋白純化系統(tǒng) Unique Autopure系列蛋白純化系統(tǒng) 主要應(yīng)用領(lǐng)域 : – 蛋白純化系統(tǒng)主要應(yīng)用于單抗、重組蛋白、疫苗、生化 藥、、天然產(chǎn)物和多糖等生物制藥領(lǐng)域。用于生物制品的下游工藝的分離純化。 Unique AutoPure 系列蛋白純化系統(tǒng) : 產(chǎn)品特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì): – 模塊化設(shè)計(jì),提供多個(gè)配置,滿(mǎn)足特殊工藝流程需求 - 低脈動(dòng)高精度雙柱塞輸液泵 ,保證優(yōu)異的分離重現(xiàn)性 ; – 全系統(tǒng)與液體接觸的地方均由生物兼容性材料組成、符合FDA、USP VI等相關(guān)法規(guī)要求 ; – DAD全譜直讀檢測(cè)器,避免了傳統(tǒng)的機(jī)械切換式檢測(cè)器所帶來(lái)的不穩(wěn)定性及高故障率 ; – 固定波長(zhǎng)檢測(cè)器燈為長(zhǎng)壽命LED燈,壽命大于8000小時(shí),降低維護(hù)成本 ; – **技術(shù)紫外檢測(cè)器流通池,低死體積、低峰拓展,提高了色譜分離度 ; – 高靈敏度在線(xiàn)pH、電導(dǎo)率、紫外檢測(cè)器,低死體積、低峰拓展,提高了色譜分離度 ; – 集中了buffer選擇閥,自動(dòng)進(jìn)樣閥、柱位閥等自動(dòng)化組件,提高了純化的自動(dòng)化程度 ; – 具有柱前、柱后、壓差報(bào)警,氣泡傳感器檢測(cè)等功能,極大的保護(hù)了系統(tǒng)及層析柱的安全性 ; – 層析工作站軟件是一款功能強(qiáng)大、性能先進(jìn)、高穩(wěn)定性的色譜數(shù)據(jù)管理系
三、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 3.3 沉降法 沉降法又稱(chēng)超速離心法。蛋白質(zhì)溶液在受到強(qiáng)大的離心力作用時(shí),蛋白質(zhì)分子趨于下沉,沉降速度與蛋白質(zhì)分子的大小、密度和分子形狀有關(guān),也與溶劑的密度和粘度有關(guān)。蛋白質(zhì)顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速度用每單位時(shí)間內(nèi)顆粒下沉的距離來(lái)表示。 在離心場(chǎng)中,蛋白質(zhì)分子所受到的凈離心力(離心力減去浮力)與溶劑的摩擦力平衡時(shí),每單位離心場(chǎng)強(qiáng)度的沉降速度稱(chēng)為沉降系數(shù)(Sedimentation Coefficient)。國(guó)際上采用Svedberg單位作為沉降系數(shù)的單位,用S表示,以紀(jì)念超速離心法的創(chuàng)始人,瑞典***的蛋白質(zhì)化學(xué)家T.Svedberg。一個(gè)Svedberg單位(或直接稱(chēng)一個(gè)S)為1×10—13s。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)大約在1×10—13~200×10—13s范圍內(nèi),即1S~200S。
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.2 蛋白質(zhì)的抽提 通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來(lái)。抽提所用緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑(十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等),使膜結(jié)構(gòu)破壞,利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過(guò)程中,應(yīng)注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質(zhì)的變性。 2.3蛋白質(zhì)粗制品的獲得 選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開(kāi)來(lái)。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行的分離。常用的有下列幾種方法: 1. 等電點(diǎn)沉淀法 不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同,可用等電點(diǎn)沉淀法使它們相互分離。 2. 鹽析法 不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過(guò)調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì),并能再度溶解而不變性。 3. 有機(jī)溶劑沉淀法 中性有機(jī)溶劑如乙醇、**,它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低,進(jìn)而從溶液中沉淀出來(lái),因此可用來(lái)沉淀蛋白質(zhì)。此外,有機(jī)溶劑會(huì)破壞蛋白質(zhì)表面的水化層,促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機(jī)溶劑會(huì)使蛋白質(zhì)變性,使用該法時(shí),要注意在低溫下操作.樣品前處理樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)
四川化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)上門(mén)安裝
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 分離純化蛋白質(zhì)的一般程序 2.1 材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 分離提純某一種蛋白質(zhì)時(shí),首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來(lái)并保持原來(lái)的天然狀態(tài),不喪失活性。所以要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。常用的破碎組織細(xì)胞的方法有: 1. 機(jī)械破碎法 這種方法是利用機(jī)械力的剪切作用,使細(xì)胞破碎。常用設(shè)備有,高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽等。 2. 滲透破碎法 這種方法是在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎。 3. 反復(fù)凍融法 生物組織經(jīng)凍結(jié)后,細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。這種方法簡(jiǎn)單方便,但要注意那些對(duì)溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。 4. 超聲波法 使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。四川化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)上門(mén)安裝
蘇州英賽斯智能科技有限公司致力于儀器儀表,是一家生產(chǎn)型的公司。英賽斯致力于為客戶(hù)提供良好的蛋白純化色譜系統(tǒng),凝膠凈化色譜系統(tǒng),制備液相色譜,柱塞泵,一切以用戶(hù)需求為中心,深受廣大客戶(hù)的歡迎。公司從事儀器儀表多年,有著創(chuàng)新的設(shè)計(jì)、強(qiáng)大的技術(shù),還有一批**的專(zhuān)業(yè)化的隊(duì)伍,確保為客戶(hù)提供良好的產(chǎn)品及服務(wù)。英賽斯秉承“客戶(hù)為尊、服務(wù)為榮、創(chuàng)意為先、技術(shù)為實(shí)”的經(jīng)營(yíng)理念,全力打造公司的重點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)力。
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