轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液(P0023C)中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。用微型臺(tái)式真空泵或滴管等吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，北京熒光Western Blot檢測(cè)分析服務(wù)，可以4℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜?；蚋鼡?jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間。微型臺(tái)式真空泵或滴管等吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)，北京熒光Western Blot檢測(cè)分析服務(wù)。 回收二抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。使用

ECL化學(xué)發(fā)光試劑來檢測(cè)蛋白。壓片可以采用**的壓片暗盒進(jìn)行。洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)，北京熒光Western Blot檢測(cè)分析服務(wù)。如果沒有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。X光片推薦選用柯達(dá)原裝的生物實(shí)驗(yàn)**柯達(dá)X-OMAT BT膠片。

Western blotting堪稱蛋白質(zhì)研究中的經(jīng)典方法。學(xué)生物的幾乎無人不曉，即使沒親手做過，也清楚其原理。經(jīng)典果然是經(jīng)典，30年來其操作步驟幾乎沒變過，依然是跑膠-轉(zhuǎn)膜-封閉-孵育-檢測(cè)。近兩年，各大公司陸續(xù)推出了Western blotting方面的新儀器，如新型轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，確實(shí)能省時(shí)省力不少，但仍然不能完全克服研究人員在面臨的挑戰(zhàn)。Western

blotting仍存在重復(fù)性差、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長、無法準(zhǔn)確定量等問題。

近日，美國proteinsimple公司推出了一種Simple Western?分析，徹底改變了整個(gè)Western blot。此分析在一臺(tái)名為Simon的儀器上開展，Simon將所有實(shí)驗(yàn)步驟自動(dòng)化，包括蛋白上樣和分離、免疫印跡、洗滌、檢測(cè)以及數(shù)據(jù)的定量分析，讓研究人員從繁重的勞動(dòng)中解放出來，同時(shí)避免了可能影響實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的人為因素。

全自動(dòng)western  blot無需凝膠、無需轉(zhuǎn)印，放入您的樣品，按個(gè)按鈕，然后就沒事了。首先，將樣品與Simple

Western樣品緩沖液混合，至終濃度1 μg/μL，還原并變性，然后將制備好的樣品、一抗和二抗、化學(xué)發(fā)光底物分配到384孔分析板的指定孔中。之后，將Simple

Western分析緩沖液、毛細(xì)管和制備好的分析板放入Simon內(nèi)，它自動(dòng)開展所有分析步驟。當(dāng)?shù)鞍籽刂?xì)管內(nèi)一個(gè)堆積和分離基質(zhì)遷移時(shí)，它們分離。分離后的蛋白固定到毛細(xì)管壁上。之后利用一抗鑒定目標(biāo)蛋白，用HRP結(jié)合的二抗和化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)蛋白。系統(tǒng)自動(dòng)報(bào)告檢測(cè)蛋白的分子量和信號(hào)。每次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)分析**多12個(gè)樣品，結(jié)果可在3-5小時(shí)內(nèi)獲得。15-150 kDa的目標(biāo)蛋白均可檢測(cè)。軟件報(bào)告每個(gè)檢測(cè)蛋白的分子量、面積、面積百分比和信噪比。對(duì)于傳統(tǒng)的Western blot而言，結(jié)果的重復(fù)性一直是個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)槿狈?biāo)準(zhǔn)化的操作，且多個(gè)操作步驟引入了實(shí)驗(yàn)可變性。而Simple Western分析是完全自動(dòng)化的，因此結(jié)果的重復(fù)性更好。整體的定量也**改善了，因?yàn)槭∪チ宿D(zhuǎn)印步驟，從而避免了蛋白轉(zhuǎn)移的不一致。

文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/157633.html