蛋白質(zhì)分離純化步驟 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則： 大多數(shù)蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞中都是和核酸等生物分子結(jié)合在一起，而且每種類型的細(xì)胞都含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì)。許多蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)上有許多相似之處，所以蛋白質(zhì)的分離提純是一項(xiàng)復(fù)雜的工作。到目前為止，還沒有一**成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中提取出來。但是對于任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一種較合適的分離純化程序以獲得高純度的制品。且分離的關(guān)鍵步驟，浙江專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門維修、基本手段還是共同的。 蛋白質(zhì)提純的目的是增加產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量，同時(shí)又要保持和提高產(chǎn)品的生物活性。因此，要分離純化某一種蛋白質(zhì)，首先應(yīng)選擇一種含目的蛋白質(zhì)較豐富的材料。其次，應(yīng)設(shè)法避免蛋白質(zhì)變性，以制備有活性的蛋白質(zhì)。對于大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，純化操作都是在0～4℃的低溫下進(jìn)行的。同時(shí)也應(yīng)避免過酸、過堿的條件以及劇烈的攪拌和振蕩，浙江專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門維修，浙江專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門維修。另外，還要設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和其它雜蛋白，從而達(dá)到增加純度和提高產(chǎn)量的目的。浙江專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門維修

三、蛋白質(zhì)分子量的測定 3.3 沉降法 沉降法又稱超速離心法。蛋白質(zhì)溶液在受到強(qiáng)大的離心力作用時(shí)，蛋白質(zhì)分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質(zhì)分子的大小、密度和分子形狀有關(guān)，也與溶劑的密度和粘度有關(guān)。蛋白質(zhì)顆粒在離心場中的沉降速度用每單位時(shí)間內(nèi)顆粒下沉的距離來表示。 在離心場中，蛋白質(zhì)分子所受到的凈離心力（離心力減去浮力）與溶劑的摩擦力平衡時(shí)，每單位離心場強(qiáng)度的沉降速度稱為沉降系數(shù)（Sedimentation Coefficient）。國際上采用Svedberg單位作為沉降系數(shù)的單位，用S表示，以紀(jì)念超速離心法的創(chuàng)始人，瑞典***的蛋白質(zhì)化學(xué)家T.Svedberg。一個(gè)Svedberg單位（或直接稱一個(gè)S）為1×10—13s。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)大約在1×10—13～200×10—13s范圍內(nèi)，即1S～200S。樣品前處理化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)制造廠家

實(shí)驗(yàn)室及中試放大規(guī)模蛋白純化系統(tǒng) Unique Autopure系列蛋白純化系統(tǒng) 主要應(yīng)用領(lǐng)域 ： – 蛋白純化系統(tǒng)主要應(yīng)用于單抗、重組蛋白、疫苗、生化 藥、、天然產(chǎn)物和多糖等生物制藥領(lǐng)域。用于生物制品的下游工藝的分離純化。 Unique AutoPure 系列蛋白純化系統(tǒng) ： 產(chǎn)品特點(diǎn)及優(yōu)勢： – 模塊化設(shè)計(jì)，提供多個(gè)配置，滿足特殊工藝流程需求 - 低脈動高精度雙柱塞輸液泵 ，保證優(yōu)異的分離重現(xiàn)性 ; – 全系統(tǒng)與液體接觸的地方均由生物兼容性材料組成、符合FDA、USP VI等相關(guān)法規(guī)要求 ; – DAD全譜直讀檢測器，避免了傳統(tǒng)的機(jī)械切換式檢測器所帶來的不穩(wěn)定性及高故障率 ; – 固定波長檢測器燈為長壽命LED燈，壽命大于8000小時(shí)，降低維護(hù)成本 ; – **技術(shù)紫外檢測器流通池，低死體積、低峰拓展，提高了色譜分離度 ; – 高靈敏度在線pH、電導(dǎo)率、紫外檢測器，低死體積、低峰拓展，提高了色譜分離度 ; – 集中了buffer選擇閥，自動進(jìn)樣閥、柱位閥等自動化組件，提高了純化的自動化程度 ; – 具有柱前、柱后、壓差報(bào)警，氣泡傳感器檢測等功能，極大的保護(hù)了系統(tǒng)及層析柱的安全性 ; – 層析工作站軟件是一款功能強(qiáng)大、性能先進(jìn)、高穩(wěn)定性的色譜數(shù)據(jù)管理系

三、蛋白質(zhì)分子量的測定 蛋白質(zhì)分子量測定的方法很多，目前常用的方法有以下幾種。 3.1 凝膠過濾法 凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)分子量的原理如“分離純化方法”中所 述。一定型號的凝膠顆粒上具有一定大小的孔隙，只允許較小的分子進(jìn)入膠粒，而大于孔隙的分子則不能進(jìn)入膠粒而被排阻在膠粒外面。用洗脫液洗脫時(shí)，被排阻的分子量大的蛋白質(zhì)先被洗脫下來，隨后能夠進(jìn)入顆粒的蛋白質(zhì)也按分子量大小而先后被洗脫下來，分子量越小的越后被洗脫下來。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質(zhì)分子量范圍，在此范圍內(nèi)，分子量的對數(shù)和洗脫體積之間成線性關(guān)系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行層析分析，以每種蛋白質(zhì)的洗脫體積對它們的分子量的對數(shù)作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線。未知蛋白質(zhì)在同樣的條件下進(jìn)行層析分析，根據(jù)其所用的洗脫體積，從標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線上可求出此未知蛋白質(zhì)對應(yīng)的分子量來。

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4.3. 親和層析 親和層析（affinity-chromatography）分離技術(shù)是根據(jù)許多蛋白質(zhì)對特定的化學(xué)基團(tuán)具有專一性結(jié)合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質(zhì)所識別并與之結(jié)合的基團(tuán)稱為配基或配體（ligand）。親和層析是一種極有效的分離純化蛋白質(zhì)的方法。例如酶對它的底物具有特殊的親和力；抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A（concanavalin A）的分離純化為例，由于該蛋白對葡萄糖有專一性親和吸附，因此可把葡萄糖通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質(zhì)大分子與其配基的結(jié)合，在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂（或稱為間隔臂，spacerarm），使配體與載體之間保持足夠的距離。 將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱。當(dāng)含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部，并沿柱從上往下過時(shí)，待純化的蛋白質(zhì)與其特異性配基結(jié)合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能與葡萄糖配基結(jié)合將通過柱子而流出（圖2-28a）。然后采用一定的洗脫條件，如濃的葡萄糖溶液進(jìn)行洗脫，即可把該蛋白質(zhì)洗脫下來，達(dá)到與其它蛋白質(zhì)分離的目的。浙江樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)

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三、蛋白質(zhì)分子量的測定 3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量 蛋白質(zhì)在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子大小、所帶電荷的量以及分子形狀。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中加入了十二烷基***鈉（sodium dodecylsulfate,SDS）。SDS是一種陰離子去污劑，可使蛋白質(zhì)變性并解離成亞基。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品中加入SDS（一般加入量為0.1％）后，SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷，這些電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原來所帶的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異。所有結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的形狀近似于長的橢園棒，它們的短軸是恒定的，而長軸與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比。這樣，消除了蛋白質(zhì)之間原有的電荷和形狀的差異，電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。 進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，常常用一種染料作前沿物質(zhì)，蛋白質(zhì)分子在電泳中的移動距離和前沿物質(zhì)移動的距離之比值稱為相對遷移率，相對遷移率和分子質(zhì)量的對數(shù)成直線關(guān)系。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)和其相對遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將未知蛋白質(zhì)在同樣條件下電泳，根據(jù)測得的樣品相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上便可查出其分子量。浙江專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門維修

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