實時熒光定量常用Taqman探針法和SYBR Green I法兩類。

1.TaqMan探針法

TaqMan 探針法是具有高度特異性的定量PCR技術(shù)。它的工作原理為有一對 PCR 引物和一條探針存在于PCR 反應(yīng)體系中，有熒光淬滅基團存在于3′

端標記，北京**基因熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，有報告基團存在于探針的5′ 端標記，探針*和模板特異結(jié)合，兩條引物之間是其結(jié)合點。因此信號儀器搜集不到，伴隨反應(yīng)的進展，探針在外切核酸酶的活性的作用下被切斷，從而造成淬滅基團不能吸收基團的熒光能量，從而使熒光信號產(chǎn)生，所以模板 DNA 的拷貝數(shù)取決于信號的強度。

2.SYBR Green I法

SYBR Green I為一種具有綠色激發(fā)波長的染料，其發(fā)射波長比較大約為 520 nm，北京**基因熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，北京**基因熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，比較大吸收波長約為 497 nm，能夠結(jié)合所有的雙螺旋小溝區(qū)域。由于處于游離狀態(tài)，SYBR Green I發(fā)出的熒光較弱，然而其結(jié)合雙鏈 DNA之后，就會使得熒光**增強，熒光信號的增加完全同步PCR 產(chǎn)物的增加。

實時熒光定量PCR的應(yīng)用

目前，qPCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥食品等行業(yè)，應(yīng)用于疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、***研究、**的診斷與研究、食品病原微生物的檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、動物疫病檢測等，除此之外，還包括：

● 基因擴增

● 擴增特異性分析

● 基因定量分析

● 基因檢測

● 基因分型

● SNP分析

● RFLP多態(tài)性分析

● 單/多基因表達研究

● 高通量基因表達譜研究

實時熒光定量PCR技術(shù)，顧名思義，就是在PCR的基礎(chǔ)上加入熒光基團，通過熒光信號的變化的實時監(jiān)測PCR的反應(yīng)過程，***通過對未知模板進行定量分析的方法。

為了正確地評估 PCR 效率，至少需要 3 次重復和至少 5 個數(shù)量級倍數(shù)的模板濃度。圖 6 說了建議此精確級別的理由，它證明在 1 個數(shù)量級倍數(shù)與 5 個數(shù)量級倍數(shù)范圍內(nèi)測試稀釋模板時，獲得的斜率或效率可能產(chǎn)生數(shù)學偏差。因此，即使檢測 ** 有效，由于每個稀釋點都存在標準差，檢測一個數(shù)量級倍數(shù)的連續(xù)稀釋時，可能獲得 70 至 170% 的范圍。在 5 個數(shù)量級倍數(shù)范圍內(nèi)做相同數(shù)量的稀釋點或重復，可能的偏移只有 ±8%。這意味著在 5 個數(shù)量級倍數(shù)范圍內(nèi)，如果效率為 94%，則該實驗的效率范圍介于 88% 到 ** 之間。為了準確測定 PCR 反應(yīng)的效率，必須進行 5 個數(shù)量級倍數(shù)的連續(xù)稀釋。-3.3 ±10% 的斜率意味著效率達到 ** ±±10%。PCR 反應(yīng)效率越低，那么靈敏度越低。

文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/183889.html