蛋白質(zhì)純化方法-親和層析親和層析法包括特異性配體親和層析法以及通用性配體親和層析法。比較這兩種親和層析法。特異性配體親和層析法通常將復雜的生命大分子物質(zhì)作為配體，它的結合力比較大河吸附選擇性比較強。而通用性配體親和層析法通常將簡單的小分子物質(zhì)作為配體，因此，它具有低廉的成本，吸附容量比較高，通過對吸附和脫附條件的改善能夠使得層析的分辨率提高。原理親和層析的原理類似于酶-底物，***-受體與抗原-抗體等特異性反應的機理。有一定的親和力在每對反應物之間。與在酶與底物的反應中，只有特異的底物才可以結合一定的酶，使復合物產(chǎn)生相同。在親和層析中，只有特異的配體才可以和一定的生命大分子有親和力，并且使復合物產(chǎn)生。親和層析配體呈固相，而酶與底物的反應底物呈液相是它們的不同點。事實上，親和層析是在含有活化基團的基質(zhì)M上以共價鍵的方式固化具有識別能力的配體L，北京直銷蛋白純化系統(tǒng)制造廠家，將固相載體制作成功而固化后的配體束縛特異物質(zhì)的能力依然保持，北京直銷蛋白純化系統(tǒng)制造廠家。所以當在小層析柱裝入固相載體，使得欲分離的樣品在該柱經(jīng)過。此時，北京直銷蛋白純化系統(tǒng)制造廠家，樣品中對配體有親和力的物質(zhì)S就能夠通過結構互補效應、范德瓦爾力與靜電引力等作用在固相載體上吸附著。 北京直銷蛋白純化系統(tǒng)制造廠家

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4.2 纖維素柱層析法 該法是利用蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)作為分離的基礎。離子交換纖維素（cellulose ion-exchanger）是人工合成的纖維素衍生物，它具有松散的親水性網(wǎng)狀結構，有較大的表面積，使蛋白質(zhì)大分子可以自由通過。因此常用于蛋白質(zhì)的分離。 （1）羧甲基纖維素（CM-纖維素） 在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團。在中性pH條件下，羧甲基上的質(zhì)子可解離下來（圖2-27a），而溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負電荷結合?？山粨Q的基團帶正電，因此是一種陽離子交換劑。蛋白質(zhì)與離子交換纖維素之間結合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團之間靜電吸引。 (2）二乙氨基乙基纖維素（DEAE-纖維素） 在中性pH條件下，它含有帶正電荷的基團，可與溶液中的帶負電荷的蛋白質(zhì)結合，可交換的基團帶負電荷，因此是一種陰離子交換劑。當某一蛋白質(zhì)混合溶液通過裝有DEAE-纖維素的層析柱時，帶正電荷的蛋白質(zhì)不能結合而隨著洗脫液的流動先被洗脫下來。帶負電荷的蛋白質(zhì)將被結合到柱上。結合力取決于彼此相反電荷基團間的靜電吸引。然后選用一定pH和離子強度的緩沖液進行洗脫，改變蛋白質(zhì)分子所帶的靜電荷，依次從層析柱流出達到相互分離的目的。北京直銷蛋白純化系統(tǒng)制造廠家

三、蛋白質(zhì)分子量的測定 3.3 沉降法 沉降法又稱超速離心法。蛋白質(zhì)溶液在受到強大的離心力作用時，蛋白質(zhì)分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質(zhì)分子的大小、密度和分子形狀有關，也與溶劑的密度和粘度有關。蛋白質(zhì)顆粒在離心場中的沉降速度用每單位時間內(nèi)顆粒下沉的距離來表示。 在離心場中，蛋白質(zhì)分子所受到的凈離心力（離心力減去浮力）與溶劑的摩擦力平衡時，每單位離心場強度的沉降速度稱為沉降系數(shù)（Sedimentation Coefficient）。國際上采用Svedberg單位作為沉降系數(shù)的單位，用S表示，以紀念超速離心法的創(chuàng)始人，瑞典***的蛋白質(zhì)化學家T.Svedberg。一個Svedberg單位（或直接稱一個S）為1×10—13s。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)大約在1×10—13～200×10—13s范圍內(nèi)，即1S～200S。

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4 樣品的進一步分離純化 用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。 1. 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析（gel-filtration chromatography）又稱為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠（Sephadex）裝入一個柱子中，制成凝膠柱。這種凝膠顆粒具有網(wǎng)狀結構，不同類型凝膠的網(wǎng)孔大小不同。當把蛋白質(zhì)混合樣品加到凝膠柱中時，比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可進入網(wǎng)孔內(nèi)，而大于網(wǎng)孔的分子則不能進入被排阻在凝膠顆粒之外。當用洗脫液洗脫時，被排阻的分子量大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠之間的縫隙先被洗脫下來，而比網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可連續(xù)不斷地進入網(wǎng)孔內(nèi)。這樣的小分子不但流經(jīng)的路程長，而且受到來自凝膠內(nèi)部的阻力也很大，所以蛋白質(zhì)越小，從柱子上洗脫下來所需時間越長。由于不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，進入網(wǎng)孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脫所用體積及時間不同，從而達到分離的目的。

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4.3. 親和層析 親和層析（affinity-chromatography）分離技術是根據(jù)許多蛋白質(zhì)對特定的化學基團具有專一性結合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質(zhì)所識別并與之結合的基團稱為配基或配體（ligand）。親和層析是一種極有效的分離純化蛋白質(zhì)的方法。例如酶對它的底物具有特殊的親和力；抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A（concanavalin A）的分離純化為例，由于該蛋白對葡萄糖有專一性親和吸附，因此可把葡萄糖通過適當?shù)幕瘜W反應共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質(zhì)大分子與其配基的結合，在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂（或稱為間隔臂，spacerarm），使配體與載體之間保持足夠的距離。 將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱。當含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部，并沿柱從上往下過時，待純化的蛋白質(zhì)與其特異性配基結合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能與葡萄糖配基結合將通過柱子而流出（圖2-28a）。然后采用一定的洗脫條件，如濃的葡萄糖溶液進行洗脫，即可把該蛋白質(zhì)洗脫下來，達到與其它蛋白質(zhì)分離的目的。北京直銷蛋白純化系統(tǒng)制造廠家

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