其中石蠟切片是制作組織標本**常用、**基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，上海七色免疫組化實驗服務，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中優(yōu)先的組織標本制作方法。免疫組化抗體免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體，單克隆抗體是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。免疫組化常用染色方法根據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗體）在細胞或亞細胞水平的定位，上海七色免疫組化實驗服務，其中生物素—抗生物素染色法**常用。免疫組化操作步驟編輯一免疫組化（SP法）操作步驟1．切片常規(guī)脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步后進行2.緩沖液洗3min/2次。3.為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在HydrogenPeroxideBlock中孵育10-15分鐘。4，上海七色免疫組化實驗服務.緩沖液洗5min/2次。5.滴加UltraVBlock。

    因而乙醇固定時間不宜過長(2h內(nèi))?！ひ掖际沟鞍鬃冃缘淖饔幂p，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度。(3)其它固定劑·**：–對抗原性的保存好，但脫水性更強，較少用于組織標本，但細胞爬片常用**固定。3、抗原修復——原因·常規(guī)的石蠟切片標本均用甲醛固定，結果使得：–抗原性物質(zhì)形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；–蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽?！ひ螅涸谌旧珪r，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復抗原的原有空間形態(tài)。3、抗原修復——方法·化學方法·加熱方法–水浴加熱法–微波照射法–高壓加熱法–酸水解法(1)化學方法·主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。–胰蛋白酶：一般使用濃度為～，消化時間為37?C，10～40**要用于細胞內(nèi)抗原的顯示；–胃蛋白酶：一般使用濃度為～，消化時間為37?C、30～180**要用于細胞間質(zhì)抗原的顯示。·例如：Laminin、CollagenIV(2)水浴加熱法·將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù)10～15分鐘。–優(yōu)點：操作簡單、經(jīng)濟，適用于所有的實驗室。

    ·若標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。?直接免疫熒光法的注意事項(續(xù))·一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象；·經(jīng)熒光染色的標本比較好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。(2)間接法又稱為熒光抗-抗體法?需要兩種抗體參與，即一抗和二抗(熒光素標記)。一抗對標本中的抗原來說起抗體的作用，但對熒光標記的二抗來說又起著抗原作用。–可用來檢測標本中未知抗原，也可檢測血清中未知抗體。?間接免疫熒光法操作步驟·標本的處理及非特異染色的封閉同直接法；·一抗染色：–加未標記的特異性抗體(通常1:100稀釋，用)，37?C作用30min或4?C過夜?！BST漂洗5min×3次(震蕩漂洗)；?間接免疫熒光法操作步驟(續(xù))·加熒光標記的二抗抗體，37?C濕盒避光作用30min?！BST避光漂洗5min×3次(例如包上錫紙，在搖床上漂洗)；·甘油緩沖液封片·鏡檢·優(yōu)點：敏感性較高，比直接法高10倍左右；制備一種熒光標記抗體，可應用于多種一抗；·缺點：是參加反應的因子較多，產(chǎn)生非特異性染色的機會增多。?間接免疫熒光法的注意事項·熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h。

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