產(chǎn)生的 ΔRn 值也不同。請(qǐng)注意，北京MiRNA 熒光定量PCR分析服務(wù)，熒光信號(hào)基線屬于非模板依賴性因素，兩種預(yù)混液的基線是不同的（圖 3A）。Ct 值的變化并沒(méi)有反映出反應(yīng)系統(tǒng)的整體性能（圖 3B）。靈敏度相當(dāng)?shù)念A(yù)混液產(chǎn)生的 Ct ***值可能不同，北京MiRNA 熒光定量PCR分析服務(wù)。

使用預(yù)混液 A 和預(yù)混液 B 在等量的人類 gDNA 中進(jìn)行 RNase P 擴(kuò)增。(A) Rn 根據(jù)循環(huán)數(shù)進(jìn)行繪制，并且顯示兩個(gè)反應(yīng)的基線。(B) 對(duì)數(shù) (ΔRn) 根據(jù)循環(huán)數(shù)進(jìn)行繪制。兩種預(yù)混液的閾值（綠線）設(shè)定為相同水平。對(duì)于相同濃度的靶標(biāo)而言，預(yù)混液 B 的 Ct 值 (CtB) 早于預(yù)混液 A 的相應(yīng)值 (CtA)，北京MiRNA 熒光定量PCR分析服務(wù)，表明預(yù)混液 B 的基線較低。使用 Applied Biosystems? 7500 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 系統(tǒng)執(zhí)行所有擴(kuò)增。

一個(gè)評(píng)估 PCR 效率的關(guān)鍵參數(shù)是 R2，它是說(shuō)明如何使用一個(gè)數(shù)值預(yù)測(cè)另一個(gè)數(shù)值的相關(guān)程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)術(shù)語(yǔ)。如果 R2 為 1，那么 Y 值 (Ct) 可以用來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè) X 值（圖7A）。如果 R2 為 0，那么就不能通過(guò) Y 值預(yù)測(cè) X 值（圖 7B）。R2 值 >0.99 表示兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)的置信度良好。

精確度

標(biāo)準(zhǔn)差（偏差的平方根）是**常用的精確度計(jì)量方法。如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都靠**均值，則標(biāo)準(zhǔn)差就??；如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)差就大。

實(shí)際上，足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)**形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)?？赏ㄟ^(guò)經(jīng)典的中心極限定理來(lái)證明，該定理稱大量**同分布隨機(jī)變量的和在無(wú)限多時(shí)趨向于正態(tài)分布。如圖 8A 所示，約 68% 的值在平均值的 1 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)，約 95% 的值在平均值的 2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)，約 99.7% 的值在平均值的 3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)。

無(wú)論 Ct ***值是多少，任何能夠有效擴(kuò)增和檢測(cè)起始模板拷貝數(shù)為 1 的系統(tǒng)都達(dá)到了靈敏度的極限。

如前文所述，效率是決定反應(yīng)靈敏度的關(guān)鍵因素（圖 5）。在檢測(cè)極低拷貝數(shù)時(shí)的另一個(gè)重要的考慮因素是，不能預(yù)期模板為正態(tài)分布。相反，它會(huì)遵循泊松分布，該分布預(yù)測(cè)在平均包含一個(gè)拷貝的起始模板的大量重復(fù)中，實(shí)際上約 37% 不含拷貝，*有約 37% 含有 1 個(gè)拷貝，18% 應(yīng)包含 2 個(gè)拷貝（見(jiàn)圖 9）。因此，為了可靠地檢測(cè)低拷貝，必須做大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)提供統(tǒng)計(jì)***性，以克服泊松分布的限制。

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