使用包含 3 種不同濃度的 ROX 染料的預(yù)混液對(duì) TGF-β 進(jìn)行擴(kuò)增。顯示 (A) Ct 值和 (B) 標(biāo)準(zhǔn)差隨 ROX 染料濃度的變化。降低 ROX 染料濃度導(dǎo)致 Ct 出現(xiàn)得更早，但是會(huì)增大標(biāo)準(zhǔn)差。使用 Applied Biosystems 7500 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 系統(tǒng)執(zhí)行所有擴(kuò)增。

Ct 隨 PCR 效率發(fā)生變化。藍(lán)色標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的效率為 **（斜率為 –3.3）。綠色標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的效率為 78%（斜率為 –4）。與高效率條件相比（藍(lán)色），天津**基因熒光定量PCR分析服務(wù)，天津**基因熒光定量PCR分析服務(wù)，在低效率條件下（綠色），天津**基因熒光定量PCR分析服務(wù)，擴(kuò)增量 Y 使 Ct 出現(xiàn)得更早。較低擴(kuò)增量 (X) 時(shí)則情況相反，與高效率條件（藍(lán)色）相比，低效率條件（綠色）使 Ct 出現(xiàn)得更晚。

PCR 反應(yīng)的效率也會(huì)影響 Ct 值。在低效率條件下進(jìn)行連續(xù)稀釋擴(kuò)增，與高效率條件下相比，可能會(huì)產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在圖 5 中，兩個(gè)樣品（X 和 Y）分別在低效率和高效率條件下擴(kuò)增，在靶濃度相同的條件下得到了不同的 Ct 值。在此示例中，盡管高效率條件（圖 5 中的藍(lán)色曲線(xiàn)）在高濃度時(shí)產(chǎn)生的 Ct 值更晚，但它在靶濃度低時(shí)卻更為靈敏。PCR 效率取決于實(shí)驗(yàn)、預(yù)混液性能和樣品質(zhì)量。通常情況下，反應(yīng)效率在 90-110% 之間都是可以接受的。另一方面，假定所有其他因素如儀器、試劑和實(shí)驗(yàn)完全相同， 該效率也有助于得出***個(gè)樣品的模板量更少的結(jié)論。然而，如果產(chǎn)生兩個(gè) Ct值使用的是不同的儀器、試劑、引物和探針或反應(yīng)體積，該結(jié)論就不成立。因此，只有在使用上文定義的相同反應(yīng)條件來(lái)比較實(shí)驗(yàn)時(shí)，Ct ***值的比較才有意義。

熒光信號(hào)**擴(kuò)增階段：只有在熒光產(chǎn)生進(jìn)入**期， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，所以在PCR反應(yīng)處于**期的某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，由此來(lái)推斷模板**初的含量而進(jìn)行定量分析。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)

在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈**級(jí)的增加，所以反應(yīng)終產(chǎn)物量與起始模板量之間已經(jīng)不存在線(xiàn)性關(guān)系，通過(guò)反應(yīng)終產(chǎn)物也算不出起始DNA拷貝數(shù)

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