實(shí)時熒光定量PCR（Real-Time PCR）技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，它是通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，然后利用熒光信號的積累強(qiáng)弱實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知的DNA模板進(jìn)行定量，實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，為快速準(zhǔn)確地分析樣本中的各類待檢物質(zhì)提供了嶄新的技術(shù)工具，北京MiRNA 熒光定量PCR檢測服務(wù)，現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及臨床**標(biāo)志物的檢測。Real-Time PCR與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比其使用了熒光探針標(biāo)記特定核酸從而提高了準(zhǔn)確性；靈敏度提高故使用較少的樣本量，北京MiRNA 熒光定量PCR檢測服務(wù)，從而減少了樣本消耗殆盡的風(fēng)險(xiǎn)，在一小時左右即可出結(jié)果，簡化了傳統(tǒng)PCR方法；全封閉管分析、利用電腦分析軟件對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時動態(tài)的檢測和自動定量，北京MiRNA 熒光定量PCR檢測服務(wù)，定量動態(tài)范圍高達(dá)五個數(shù)量級，且結(jié)果重現(xiàn)性較好，這也提高了檢測的靈敏度和精密度。

熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)步驟（1） 

樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

②每樣品加入1ml的TRIZOL試劑裂解，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用移液器反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

Rn 值是由 Applied Biosystems? FAM? 染料的熒光除以 ROX 染料的熒光而計(jì)算得出的比率。因此，假定 FAM 染料產(chǎn)生的熒光信號保持不變，ROX 染料量越少，產(chǎn)生的 Rn 值就越高。這將導(dǎo)致 Rn 基線上升，以及隨后 ΔRn 的減少和 Ct 值的變化。通過降低 ROX 染料水平而得到不同 Ct 值，沒有對反應(yīng)的真實(shí)靈敏度產(chǎn)生任何影響，卻有著意想不到的后果。如圖 4 所示，降低 ROX 染料的濃度可能會增加 Ct 值的標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)準(zhǔn)差越大，分辨靶濃度之間的細(xì)微區(qū)別的可信度就越低（參加下文的精確度一節(jié)）。

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