蛋白質(zhì)分離純化步驟 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則： 大多數(shù)蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞中都是和核酸等生物分子結(jié)合在一起，而且每種類型的細(xì)胞都含有成千上萬(wàn)種不同的蛋白質(zhì)。許多蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)上有許多相似之處，所以蛋白質(zhì)的分離提純是一項(xiàng)復(fù)雜的工作。到目前為止，還沒(méi)有一**成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中提取出來(lái)。但是對(duì)于任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一種較合適的分離純化程序以獲得高純度的制品。且分離的關(guān)鍵步驟、基本手段還是共同的。 蛋白質(zhì)提純的目的是增加產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量，同時(shí)又要保持和提高產(chǎn)品的生物活性。因此，要分離純化某一種蛋白質(zhì)，首先應(yīng)選擇一種含目的蛋白質(zhì)較豐富的材料。其次，應(yīng)設(shè)法避免蛋白質(zhì)變性，以制備有活性的蛋白質(zhì)。對(duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，純化操作都是在0～4℃的低溫下進(jìn)行的。同時(shí)也應(yīng)避免過(guò)酸，山東化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)，山東化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)、過(guò)堿的條件以及劇烈的攪拌和振蕩，山東化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)。另外，還要設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和其它雜蛋白，從而達(dá)到增加純度和提高產(chǎn)量的目的。山東化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4 樣品的進(jìn)一步分離純化 用等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進(jìn)一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過(guò)濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。 1. 凝膠過(guò)濾層析 凝膠過(guò)濾層析（gel-filtration chromatography）又稱為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠（Sephadex）裝入一個(gè)柱子中，制成凝膠柱。這種凝膠顆粒具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不同類型凝膠的網(wǎng)孔大小不同。當(dāng)把蛋白質(zhì)混合樣品加到凝膠柱中時(shí)，比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可進(jìn)入網(wǎng)孔內(nèi)，而大于網(wǎng)孔的分子則不能進(jìn)入被排阻在凝膠顆粒之外。當(dāng)用洗脫液洗脫時(shí)，被排阻的分子量大的蛋白質(zhì)直接通過(guò)凝膠之間的縫隙先被洗脫下來(lái)，而比網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可連續(xù)不斷地進(jìn)入網(wǎng)孔內(nèi)。這樣的小分子不但流經(jīng)的路程長(zhǎng)，而且受到來(lái)自凝膠內(nèi)部的阻力也很大，所以蛋白質(zhì)越小，從柱子上洗脫下來(lái)所需時(shí)間越長(zhǎng)。由于不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，進(jìn)入網(wǎng)孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脫所用體積及時(shí)間不同，從而達(dá)到分離的目的。浙江蛋白純化系統(tǒng)制造廠家

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4.3. 親和層析 親和層析（affinity-chromatography）分離技術(shù)是根據(jù)許多蛋白質(zhì)對(duì)特定的化學(xué)基團(tuán)具有專一性結(jié)合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質(zhì)所識(shí)別并與之結(jié)合的基團(tuán)稱為配基或配體（ligand）。親和層析是一種極有效的分離純化蛋白質(zhì)的方法。例如酶對(duì)它的底物具有特殊的親和力；抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A（concanavalin A）的分離純化為例，由于該蛋白對(duì)葡萄糖有專一性親和吸附，因此可把葡萄糖通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質(zhì)大分子與其配基的結(jié)合，在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂（或稱為間隔臂，spacerarm），使配體與載體之間保持足夠的距離。 將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱。當(dāng)含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部，并沿柱從上往下過(guò)時(shí)，待純化的蛋白質(zhì)與其特異性配基結(jié)合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能與葡萄糖配基結(jié)合將通過(guò)柱子而流出（圖2-28a）。然后采用一定的洗脫條件，如濃的葡萄糖溶液進(jìn)行洗脫，即可把該蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，達(dá)到與其它蛋白質(zhì)分離的目的。

    蛋白質(zhì)純化方法-親和層析親和層析法包括特異性配體親和層析法以及通用性配體親和層析法。比較這兩種親和層析法。特異性配體親和層析法通常將復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)作為配體，它的結(jié)合力比較大河吸附選擇性比較強(qiáng)。而通用性配體親和層析法通常將簡(jiǎn)單的小分子物質(zhì)作為配體，因此，它具有低廉的成本，吸附容量比較高，通過(guò)對(duì)吸附和脫附條件的改善能夠使得層析的分辨率提高。原理親和層析的原理類似于酶-底物，***-受體與抗原-抗體等特異性反應(yīng)的機(jī)理。有一定的親和力在每對(duì)反應(yīng)物之間。與在酶與底物的反應(yīng)中，只有特異的底物才可以結(jié)合一定的酶，使復(fù)合物產(chǎn)生相同。在親和層析中，只有特異的配體才可以和一定的生命大分子有親和力，并且使復(fù)合物產(chǎn)生。親和層析配體呈固相，而酶與底物的反應(yīng)底物呈液相是它們的不同點(diǎn)。事實(shí)上，親和層析是在含有活化基團(tuán)的基質(zhì)M上以共價(jià)鍵的方式固化具有識(shí)別能力的配體L，將固相載體制作成功而固化后的配體束縛特異物質(zhì)的能力依然保持。所以當(dāng)在小層析柱裝入固相載體，使得欲分離的樣品在該柱經(jīng)過(guò)。此時(shí)，樣品中對(duì)配體有親和力的物質(zhì)S就能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)、范德瓦爾力與靜電引力等作用在固相載體上吸附著。

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 分離純化蛋白質(zhì)的一般程序 2.1 材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 分離提純某一種蛋白質(zhì)時(shí)，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來(lái)并保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不喪失活性。所以要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。常用的破碎組織細(xì)胞的方法有： 1. 機(jī)械破碎法 這種方法是利用機(jī)械力的剪切作用，使細(xì)胞破碎。常用設(shè)備有，高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽等。 2. 滲透破碎法 這種方法是在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎。 3. 反復(fù)凍融法 生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。這種方法簡(jiǎn)單方便，但要注意那些對(duì)溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。 4. 超聲波法 使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。浙江蛋白純化系統(tǒng)制造廠家

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三、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定分子量 蛋白質(zhì)在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子大小、所帶電荷的量以及分子形狀。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中加入了十二烷基***鈉（sodium dodecylsulfate,SDS）。SDS是一種陰離子去污劑，可使蛋白質(zhì)變性并解離成亞基。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品中加入SDS（一般加入量為0.1％）后，SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷，這些電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原來(lái)所帶的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異。所有結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的形狀近似于長(zhǎng)的橢園棒，它們的短軸是恒定的，而長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比。這樣，消除了蛋白質(zhì)之間原有的電荷和形狀的差異，電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。 進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，常常用一種染料作前沿物質(zhì)，蛋白質(zhì)分子在電泳中的移動(dòng)距離和前沿物質(zhì)移動(dòng)的距離之比值稱為相對(duì)遷移率，相對(duì)遷移率和分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成直線關(guān)系。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)和其相對(duì)遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將未知蛋白質(zhì)在同樣條件下電泳，根據(jù)測(cè)得的樣品相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上便可查出其分子量。山東化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)

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