但也存在主次之分，出現(xiàn)問(wèn)題了，需要通過(guò)先排除主要的，再依次排除次要的--這是衡量你對(duì)免疫組化原理掌握與否的關(guān)鍵所在。案例三石蠟切片免疫熒光染色呈陰性結(jié)果或非特異性結(jié)果背景：因?qū)嶒?yàn)需要，于2008年07月04日初次做肝臟組織ZO-1（一種胞膜蛋白，緊密連接蛋白）免疫熒光染色，以前我對(duì)酶免疫組化非常熟悉，在丁香園子內(nèi)也有不少置頂貼和精華帖，但免疫熒光一直還沒(méi)做過(guò)（原理知道，但細(xì)節(jié)不太了解）。我先用石蠟切片做了5次，結(jié)果一直不理想（表現(xiàn)為未見(jiàn)特異性強(qiáng)染色）；近幾日，在舜田生物老師的幫助下，我又切了冰凍切片，做了2次，終于基本成功了。在這個(gè)過(guò)程中，我對(duì)免疫熒光染色技術(shù)有了全新的認(rèn)識(shí)，而前些天發(fā)出免疫熒光求助貼，回復(fù)的很少，所以有必要加強(qiáng)對(duì)免疫熒光方面的討論），不妥之處敬請(qǐng)指正，上海七色免疫組化，上海七色免疫組化。有人會(huì)問(wèn)酶免疫組化做的好好的，為何要做免疫熒光？其實(shí)，這也是我以前思考的難題，現(xiàn)在我認(rèn)為可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫組化可能做不出來(lái)，上海七色免疫組化，需要敏感的免疫熒光方法來(lái)進(jìn)行蛋白檢測(cè)（我是看許多外文文獻(xiàn)都是這樣做的，因此選擇免疫熒光染色。

    福爾馬林)應(yīng)用**廣–原理：形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型而使之固定。–優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)，組織收縮少。–缺點(diǎn)：·甲醛放置過(guò)久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；·醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇的三維構(gòu)象出現(xiàn)空間障礙；·分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露?？稍斐杉訇幮缘娜旧Y(jié)果。–注意事項(xiàng)：·縮短固定時(shí)間，降低固定溫度(4?C)，為此組織塊不宜過(guò)厚?！じ挠弥行跃彌_福爾馬林，以pH值～，減少固定液pH的變化。·固定后充分水洗以減少分子間交聯(lián)。·切片在作免疫組化染色前，先經(jīng)預(yù)處理使抗原再現(xiàn)(抗原修復(fù))。·戊二醛：–穿透性強(qiáng)，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存好，但對(duì)抗原有一定影響，常與其他固定劑聯(lián)合用作免疫電鏡固定液?！ざ嗑奂兹?常用4%)：–可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光染色?！ぶ饕獧z測(cè)組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。(2)醇類·**常用的醇類固定劑是乙醇。–其固定作用：使細(xì)胞內(nèi)蛋白、糖類發(fā)生沉淀。–優(yōu)點(diǎn)：穿透性強(qiáng)、抗原性保存好。–缺點(diǎn)：·脫水性強(qiáng)，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量。

    問(wèn)題及其解答：產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？1、抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是**重要的一條。2、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。3、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；4、非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；5、DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高；6、PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要；7、標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。我的實(shí)際解決方案：以上的分析可能對(duì)于初學(xué)者還是不容易的，下面我就把我的排除實(shí)驗(yàn)的具體過(guò)程與大家進(jìn)行分享、交流和討論。1、首先排除抗體孵育條件。一般來(lái)說(shuō)，著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的，由于用SP法已經(jīng)做出來(lái)過(guò)一次且效果不錯(cuò)，因此對(duì)于同樣組織的同一抗原進(jìn)行分析，這種因素可以先排除。2、其次，DAB孵育時(shí)間是否太長(zhǎng)？做出來(lái)那一次我是孵育8min，后來(lái)也是8-10min。

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