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蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.4.3. 親和層析 親和層析(affinity-chromatography)分離技術(shù)是根據(jù)許多蛋白質(zhì)對特定的化學(xué)基團(tuán)具有專一性結(jié)合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質(zhì)所識別并與之結(jié)合的基團(tuán)稱為配基或配體(ligand)。親和層析是一種極有效的分離純化蛋白質(zhì)的方法,四川蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)。例如酶對它的底物具有特殊的親和力;抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A(concanavalin A)的分離純化為例,由于該蛋白對葡萄糖有專一性親和吸附,因此可把葡萄糖通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質(zhì)大分子與其配基的結(jié)合,在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂(或稱為間隔臂,spacerarm),使配體與載體之間保持足夠的距離,四川蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)。 將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱。當(dāng)含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部,四川蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià),并沿柱從上往下過時(shí),待純化的蛋白質(zhì)與其特異性配基結(jié)合而被吸附到柱上,其他蛋白因不能與葡萄糖配基結(jié)合將通過柱子而流出(圖2-28a)。然后采用一定的洗脫條件,如濃的葡萄糖溶液進(jìn)行洗脫,即可把該蛋白質(zhì)洗脫下來,達(dá)到與其它蛋白質(zhì)分離的目的。四川蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.4.2 纖維素柱層析法 該法是利用蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)作為分離的基礎(chǔ)。離子交換纖維素(cellulose ion-exchanger)是人工合成的纖維素衍生物,它具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),有較大的表面積,使蛋白質(zhì)大分子可以自由通過。因此常用于蛋白質(zhì)的分離。 (1)羧甲基纖維素(CM-纖維素) 在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團(tuán)。在中性pH條件下,羧甲基上的質(zhì)子可解離下來(圖2-27a),而溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負(fù)電荷結(jié)合。可交換的基團(tuán)帶正電,因此是一種陽離子交換劑。蛋白質(zhì)與離子交換纖維素之間結(jié)合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團(tuán)之間靜電吸引。 (2)二乙氨基乙基纖維素(DEAE-纖維素) 在中性pH條件下,它含有帶正電荷的基團(tuán),可與溶液中的帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合,可交換的基團(tuán)帶負(fù)電荷,因此是一種陰離子交換劑。當(dāng)某一蛋白質(zhì)混合溶液通過裝有DEAE-纖維素的層析柱時(shí),帶正電荷的蛋白質(zhì)不能結(jié)合而隨著洗脫液的流動先被洗脫下來。帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)將被結(jié)合到柱上。結(jié)合力取決于彼此相反電荷基團(tuán)間的靜電吸引。然后選用一定pH和離子強(qiáng)度的緩沖液進(jìn)行洗脫,改變蛋白質(zhì)分子所帶的靜電荷,依次從層析柱流出達(dá)到相互分離的目的。智能蛋白純化系統(tǒng)
蛋白質(zhì)純化方法-親和層析親和層析法包括特異性配體親和層析法以及通用性配體親和層析法。比較這兩種親和層析法。特異性配體親和層析法通常將復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)作為配體,它的結(jié)合力比較大河吸附選擇性比較強(qiáng)。而通用性配體親和層析法通常將簡單的小分子物質(zhì)作為配體,因此,它具有低廉的成本,吸附容量比較高,通過對吸附和脫附條件的改善能夠使得層析的分辨率提高。原理親和層析的原理類似于酶-底物,***-受體與抗原-抗體等特異性反應(yīng)的機(jī)理。有一定的親和力在每對反應(yīng)物之間。與在酶與底物的反應(yīng)中,只有特異的底物才可以結(jié)合一定的酶,使復(fù)合物產(chǎn)生相同。在親和層析中,只有特異的配體才可以和一定的生命大分子有親和力,并且使復(fù)合物產(chǎn)生。親和層析配體呈固相,而酶與底物的反應(yīng)底物呈液相是它們的不同點(diǎn)。事實(shí)上,親和層析是在含有活化基團(tuán)的基質(zhì)M上以共價(jià)鍵的方式固化具有識別能力的配體L,將固相載體制作成功而固化后的配體束縛特異物質(zhì)的能力依然保持。所以當(dāng)在小層析柱裝入固相載體,使得欲分離的樣品在該柱經(jīng)過。此時(shí),樣品中對配體有親和力的物質(zhì)S就能夠通過結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)、范德瓦爾力與靜電引力等作用在固相載體上吸附著。
三、蛋白質(zhì)分子量的測定 3.3 沉降法 沉降法又稱超速離心法。蛋白質(zhì)溶液在受到強(qiáng)大的離心力作用時(shí),蛋白質(zhì)分子趨于下沉,沉降速度與蛋白質(zhì)分子的大小、密度和分子形狀有關(guān),也與溶劑的密度和粘度有關(guān)。蛋白質(zhì)顆粒在離心場中的沉降速度用每單位時(shí)間內(nèi)顆粒下沉的距離來表示。 在離心場中,蛋白質(zhì)分子所受到的凈離心力(離心力減去浮力)與溶劑的摩擦力平衡時(shí),每單位離心場強(qiáng)度的沉降速度稱為沉降系數(shù)(Sedimentation Coefficient)。國際上采用Svedberg單位作為沉降系數(shù)的單位,用S表示,以紀(jì)念超速離心法的創(chuàng)始人,瑞典***的蛋白質(zhì)化學(xué)家T.Svedberg。一個(gè)Svedberg單位(或直接稱一個(gè)S)為1×10—13s。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)大約在1×10—13~200×10—13s范圍內(nèi),即1S~200S。
實(shí)驗(yàn)室及中試放大規(guī)模蛋白純化系統(tǒng) Unique Autopure系列蛋白純化系統(tǒng) 主要應(yīng)用領(lǐng)域 : – 蛋白純化系統(tǒng)主要應(yīng)用于單抗、重組蛋白、疫苗、生化 藥、、天然產(chǎn)物和多糖等生物制藥領(lǐng)域。用于生物制品的下游工藝的分離純化。 Unique AutoPure 系列蛋白純化系統(tǒng) : 產(chǎn)品特點(diǎn)及優(yōu)勢: – 模塊化設(shè)計(jì),提供多個(gè)配置,滿足特殊工藝流程需求 - 低脈動高精度雙柱塞輸液泵 ,保證優(yōu)異的分離重現(xiàn)性 ; – 全系統(tǒng)與液體接觸的地方均由生物兼容性材料組成、符合FDA、USP VI等相關(guān)法規(guī)要求 ; – DAD全譜直讀檢測器,避免了傳統(tǒng)的機(jī)械切換式檢測器所帶來的不穩(wěn)定性及高故障率 ; – 固定波長檢測器燈為長壽命LED燈,壽命大于8000小時(shí),降低維護(hù)成本 ; – **技術(shù)紫外檢測器流通池,低死體積、低峰拓展,提高了色譜分離度 ; – 高靈敏度在線pH、電導(dǎo)率、紫外檢測器,低死體積、低峰拓展,提高了色譜分離度 ; – 集中了buffer選擇閥,自動進(jìn)樣閥、柱位閥等自動化組件,提高了純化的自動化程度 ; – 具有柱前、柱后、壓差報(bào)警,氣泡傳感器檢測等功能,極大的保護(hù)了系統(tǒng)及層析柱的安全性 ; – 層析工作站軟件是一款功能強(qiáng)大、性能先進(jìn)、高穩(wěn)定性的色譜數(shù)據(jù)管理系四川直銷蛋白純化系統(tǒng)上門安裝
四川蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.4 樣品的進(jìn)一步分離純化 用等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì),須進(jìn)一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有:凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。 1. 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析(gel-filtration chromatography)又稱為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠(Sephadex)裝入一個(gè)柱子中,制成凝膠柱。這種凝膠顆粒具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),不同類型凝膠的網(wǎng)孔大小不同。當(dāng)把蛋白質(zhì)混合樣品加到凝膠柱中時(shí),比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可進(jìn)入網(wǎng)孔內(nèi),而大于網(wǎng)孔的分子則不能進(jìn)入被排阻在凝膠顆粒之外。當(dāng)用洗脫液洗脫時(shí),被排阻的分子量大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠之間的縫隙先被洗脫下來,而比網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可連續(xù)不斷地進(jìn)入網(wǎng)孔內(nèi)。這樣的小分子不但流經(jīng)的路程長,而且受到來自凝膠內(nèi)部的阻力也很大,所以蛋白質(zhì)越小,從柱子上洗脫下來所需時(shí)間越長。由于不同蛋白質(zhì)的分子大小不同,進(jìn)入網(wǎng)孔的程度不同,因此流出的速度不同,洗脫所用體積及時(shí)間不同,從而達(dá)到分離的目的。四川蛋白純化系統(tǒng)廠家報(bào)價(jià)
蘇州英賽斯智能科技有限公司是一家機(jī)器人與自動化設(shè)備、機(jī)械電子設(shè)備的研發(fā)、生產(chǎn)、銷售及技術(shù)咨詢;光學(xué)檢測設(shè)備、光電產(chǎn)品研發(fā)、制造、銷售;實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、儀器儀表的研發(fā)、制造、銷售及提供相關(guān)的技術(shù)咨詢和售后服務(wù);自營和代理各類商品及技術(shù)的進(jìn)出口業(yè)務(wù)(限定企業(yè)經(jīng)營或禁止進(jìn)出口的商品和技術(shù)除外)。(依法需經(jīng)批準(zhǔn)的項(xiàng)目,經(jīng)相關(guān)部門批準(zhǔn)后方可開展經(jīng)營活動)的公司,是一家集研發(fā)、設(shè)計(jì)、生產(chǎn)和銷售為一體的專業(yè)化公司。英賽斯擁有一支經(jīng)驗(yàn)豐富、技術(shù)創(chuàng)新的專業(yè)研發(fā)團(tuán)隊(duì),以高度的專注和執(zhí)著為客戶提供蛋白純化色譜系統(tǒng),凝膠凈化色譜系統(tǒng),制備液相色譜,柱塞泵。英賽斯始終以本分踏實(shí)的精神和必勝的信念,影響并帶動團(tuán)隊(duì)取得成功。英賽斯始終關(guān)注自身,在風(fēng)云變化的時(shí)代,對自身的建設(shè)毫不懈怠,高度的專注與執(zhí)著使英賽斯在行業(yè)的從容而自信。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/2237429.html
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