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產(chǎn)品關(guān)鍵詞:上海病原微生物熒光定量PCR課題承包
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詳細說明
Rn 值是由 Applied Biosystems? FAM? 染料的熒光除以 ROX 染料的熒光而計算得出的比率。因此,假定 FAM 染料產(chǎn)生的熒光信號保持不變,ROX 染料量越少,上海病原微生物熒光定量PCR課題承包,產(chǎn)生的 Rn 值就越高。這將導致 Rn 基線上升,以及隨后 ΔRn 的減少和 Ct 值的變化。通過降低 ROX 染料水平而得到不同 Ct 值,上海病原微生物熒光定量PCR課題承包,沒有對反應(yīng)的真實靈敏度產(chǎn)生任何影響,卻有著意想不到的后果。如圖 4 所示,上海病原微生物熒光定量PCR課題承包,降低 ROX 染料的濃度可能會增加 Ct 值的標準差。標準差越大,分辨靶濃度之間的細微區(qū)別的可信度就越低(參加下文的精確度一節(jié))。
PCR 反應(yīng)的效率也會影響 Ct 值。在低效率條件下進行連續(xù)稀釋擴增,與高效率條件下相比,可能會產(chǎn)生斜率不同的標準曲線。在圖 5 中,兩個樣品(X 和 Y)分別在低效率和高效率條件下擴增,在靶濃度相同的條件下得到了不同的 Ct 值。在此示例中,盡管高效率條件(圖 5 中的藍色曲線)在高濃度時產(chǎn)生的 Ct 值更晚,但它在靶濃度低時卻更為靈敏。PCR 效率取決于實驗、預(yù)混液性能和樣品質(zhì)量。通常情況下,反應(yīng)效率在 90-110% 之間都是可以接受的。另一方面,假定所有其他因素如儀器、試劑和實驗完全相同, 該效率也有助于得出***個樣品的模板量更少的結(jié)論。然而,如果產(chǎn)生兩個 Ct值使用的是不同的儀器、試劑、引物和探針或反應(yīng)體積,該結(jié)論就不成立。因此,只有在使用上文定義的相同反應(yīng)條件來比較實驗時,Ct ***值的比較才有意義。
使用可高壓處理的移液器,由于移液器容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本 DNA 的污染,因此要使用可高壓處理的移液器 。嚴格按照試驗的分區(qū)進行操作,按照提取區(qū)、擴增區(qū)、檢測區(qū)單方向流動,物品、樣品和試劑不可逆向流動 。操作多份樣品時,制備反應(yīng)混合液,先將熒光 PCR 反應(yīng)液、熒光探針和酶混合好,然后分裝到每個 PCR 管中,這樣即可以減少操作次數(shù),避免污染,又可以增加反應(yīng)的精確度 。加樣品、加蛋白酶 K 和加樣品過程中,特別注意防止樣品的交叉污染和酶的降解 。操作時設(shè)立陰性及陽性對照,可驗證熒光 PCR反應(yīng)的準確性和可信性
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/225166.html
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