熒光定量PCR實驗步驟：

  取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

  兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%，北京臨床疾病熒光定量PCR分析服務(wù)。

  RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，北京臨床疾病熒光定量PCR分析服務(wù)，北京臨床疾病熒光定量PCR分析服務(wù)，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

TaqMan探針法：TaqMan 探針法是具有高度特異性的定量 PCR 技術(shù)。它的工作原理是在 PCR 反應(yīng)體系中存在一對 PCR 引物和一條探針，探針的5′ 端標(biāo)記有報告基團(tuán)，3′ 端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，探針只與模板特異結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。當(dāng)探針完整的時候，報告基團(tuán)的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，所以儀器搜集不到信號，隨著反應(yīng)的進(jìn)展，Taq酶遇到探針，利用 3′→5′ 外切核酸酶的活性把探針切斷，導(dǎo)致報告基團(tuán)的熒光能量不能被淬滅基團(tuán)吸收，產(chǎn)生了熒光信號，因此信號的強(qiáng)度就**了模板 DNA 的拷貝數(shù)

為了正確地評估 PCR 效率，至少需要 3 次重復(fù)和至少 5 個數(shù)量級倍數(shù)的模板濃度。圖 6 說了建議此精確級別的理由，它證明在 1 個數(shù)量級倍數(shù)與 5 個數(shù)量級倍數(shù)范圍內(nèi)測試稀釋模板時，獲得的斜率或效率可能產(chǎn)生數(shù)學(xué)偏差。因此，即使檢測 ** 有效，由于每個稀釋點都存在標(biāo)準(zhǔn)差，檢測一個數(shù)量級倍數(shù)的連續(xù)稀釋時，可能獲得 70 至 170% 的范圍。在 5 個數(shù)量級倍數(shù)范圍內(nèi)做相同數(shù)量的稀釋點或重復(fù)，可能的偏移只有 ±8%。這意味著在 5 個數(shù)量級倍數(shù)范圍內(nèi)，如果效率為 94%，則該實驗的效率范圍介于 88% 到 ** 之間。為了準(zhǔn)確測定 PCR 反應(yīng)的效率，必須進(jìn)行 5 個數(shù)量級倍數(shù)的連續(xù)稀釋。-3.3 ±10% 的斜率意味著效率達(dá)到 ** ±±10%。PCR 反應(yīng)效率越低，那么靈敏度越低。

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