實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）指的是在PCR進行的同時，對其過程進行監(jiān)測的能力（即實時）。因此，數(shù)據(jù)可在PCR擴增過程中，而非PCR結(jié)束之后，進行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了**性的變革。在實時熒光定量PCR (qPCR)中，反應以循環(huán)中***檢測到目標擴增的時間點為特征，而非在一定循環(huán)數(shù)后目標分子累計的擴增量，江蘇熒光定量PCR課題承包，江蘇熒光定量PCR課題承包。目標核酸的起始拷貝數(shù)越高，則會越快觀察到熒光的***增加，江蘇熒光定量PCR課題承包。相反，終點法檢測（也稱 “讀板檢測”）測量的是PCR循環(huán)結(jié)束時累計的PCR產(chǎn)物量。江蘇熒光定量PCR課題承包

熒光信號**擴增階段：只有在熒光產(chǎn)生進入**期， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，所以在PCR反應處于**期的某一點上來檢測PCR產(chǎn)物的量，由此來推斷模板**初的含量而進行定量分析。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可得到標準曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)

在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈**級的增加，所以反應終產(chǎn)物量與起始模板量之間已經(jīng)不存在線性關(guān)系，通過反應終產(chǎn)物也算不出起始DNA拷貝數(shù) 上海DNA甲基化熒光定量PCR課題承包

管家基因反應體系： 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl 3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待測樣品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

  制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。 針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。

  反應體系： 序號 反應物 劑量 1 10×PCR緩沖液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至總體積為 25ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

  35個PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72℃延伸5分鐘。

  PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。

  將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。 所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。

實時熒光定量常用Taqman探針法和SYBR Green I法兩類。

1.TaqMan探針法

TaqMan 探針法是具有高度特異性的定量PCR技術(shù)。它的工作原理為有一對 PCR 引物和一條探針存在于PCR 反應體系中，有熒光淬滅基團存在于3′

端標記，有報告基團存在于探針的5′ 端標記，探針*和模板特異結(jié)合，兩條引物之間是其結(jié)合點。因此信號儀器搜集不到，伴隨反應的進展，探針在外切核酸酶的活性的作用下被切斷，從而造成淬滅基團不能吸收基團的熒光能量，從而使熒光信號產(chǎn)生，所以模板 DNA 的拷貝數(shù)取決于信號的強度。

2.SYBR Green I法

SYBR Green I為一種具有綠色激發(fā)波長的染料，其發(fā)射波長比較大約為 520 nm，比較大吸收波長約為 497 nm，能夠結(jié)合所有的雙螺旋小溝區(qū)域。由于處于游離狀態(tài)，SYBR Green I發(fā)出的熒光較弱，然而其結(jié)合雙鏈 DNA之后，就會使得熒光**增強，熒光信號的增加完全同步PCR 產(chǎn)物的增加。

熒光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase ChainReaction，F(xiàn)Q-PCR；real-time quantitative PCR, RT-qPCR or qPCR)， 是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術(shù)，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，標記PCR產(chǎn)物進行實時監(jiān)測反應，利用與之相適應的軟件對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度

實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，是1996年美國Applied

Biosystems公司推出，它是通過在PCR反應體系中加入熒光基團，然后利用熒光信號的積累強弱實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線對未知的DNA模板進行定量。 上海DNA甲基化熒光定量PCR課題承包

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熒光染料可與雙鏈DNA結(jié)合，每個循環(huán)的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。同時，其缺點也在于其非特異性。當PCR反應中有引物二聚體或者非特異性擴增時，該染料也可以和這些非特異性擴增產(chǎn)物結(jié)合，發(fā)出熒光，從而干擾對特異性產(chǎn)物的準確定量。

常用的染料為SYBR Green I，各公司針對熒光信號強度、***作用等進行改進，也推出了很多新的染料供大家選擇。

Promega采用新型熒光染料BRYT Green® Dye，對qPCR反應沒有***作用，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光信號更強. 江蘇熒光定量PCR課題承包

上海朝瑞生物科技有限公司注冊資金700-1000萬元，是一家擁有5~10人***員工的企業(yè)。公司自成立以來，以質(zhì)量為發(fā)展，讓匠心彌散在每個細節(jié)，公司旗下[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學產(chǎn)品銷售" ]深受客戶的喜愛。公司秉持誠信為本的經(jīng)營理念，在化工深耕多年，以技術(shù)為先導，以自主產(chǎn)品為**，發(fā)揮人才優(yōu)勢，打造化工質(zhì)量品牌。在社會各界的鼎力支持下，經(jīng)過公司所有人員的努力，公司自2003-01-22成立以來，年營業(yè)額達到2000-3000萬元。

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