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詳細說明
蛋白質(zhì)純化方法-親和層析親和層析法包括特異性配體親和層析法以及通用性配體親和層析法。比較這兩種親和層析法。特異性配體親和層析法通常將復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)作為配體,它的結(jié)合力比較大河吸附選擇性比較強。而通用性配體親和層析法通常將簡單的小分子物質(zhì)作為配體,因此,它具有低廉的成本,吸附容量比較高,通過對吸附和脫附條件的改善能夠使得層析的分辨率提高。原理親和層析的原理類似于酶-底物,***-受體與抗原-抗體等特異性反應(yīng)的機理。有一定的親和力在每對反應(yīng)物之間。與在酶與底物的反應(yīng)中,只有特異的底物才可以結(jié)合一定的酶,使復(fù)合物產(chǎn)生相同。在親和層析中,只有特異的配體才可以和一定的生命大分子有親和力,并且使復(fù)合物產(chǎn)生。親和層析配體呈固相,蛋白純化系統(tǒng)上門維修,蛋白純化系統(tǒng)上門維修,而酶與底物的反應(yīng)底物呈液相是它們的不同點。事實上,親和層析是在含有活化基團的基質(zhì)M上以共價鍵的方式固化具有識別能力的配體L,將固相載體制作成功而固化后的配體束縛特異物質(zhì)的能力依然保持。所以當(dāng)在小層析柱裝入固相載體,使得欲分離的樣品在該柱經(jīng)過,蛋白純化系統(tǒng)上門維修。此時,樣品中對配體有親和力的物質(zhì)S就能夠通過結(jié)構(gòu)互補效應(yīng)、范德瓦爾力與靜電引力等作用在固相載體上吸附著。 蛋白純化系統(tǒng)上門維修
蛋白質(zhì)分離純化步驟 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則: 大多數(shù)蛋白質(zhì)在組織細胞中都是和核酸等生物分子結(jié)合在一起,而且每種類型的細胞都含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì)。許多蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)上有許多相似之處,所以蛋白質(zhì)的分離提純是一項復(fù)雜的工作。到目前為止,還沒有一**成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中提取出來。但是對于任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一種較合適的分離純化程序以獲得高純度的制品。且分離的關(guān)鍵步驟、基本手段還是共同的。 蛋白質(zhì)提純的目的是增加產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量,同時又要保持和提高產(chǎn)品的生物活性。因此,要分離純化某一種蛋白質(zhì),首先應(yīng)選擇一種含目的蛋白質(zhì)較豐富的材料。其次,應(yīng)設(shè)法避免蛋白質(zhì)變性,以制備有活性的蛋白質(zhì)。對于大多數(shù)蛋白質(zhì)來說,純化操作都是在0~4℃的低溫下進行的。同時也應(yīng)避免過酸、過堿的條件以及劇烈的攪拌和振蕩。另外,還要設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和其它雜蛋白,從而達到增加純度和提高產(chǎn)量的目的。蛋白純化系統(tǒng)上門維修
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.4.2 纖維素柱層析法 該法是利用蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)作為分離的基礎(chǔ)。離子交換纖維素(cellulose ion-exchanger)是人工合成的纖維素衍生物,它具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),有較大的表面積,使蛋白質(zhì)大分子可以自由通過。因此常用于蛋白質(zhì)的分離。 (1)羧甲基纖維素(CM-纖維素) 在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團。在中性pH條件下,羧甲基上的質(zhì)子可解離下來(圖2-27a),而溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負電荷結(jié)合??山粨Q的基團帶正電,因此是一種陽離子交換劑。蛋白質(zhì)與離子交換纖維素之間結(jié)合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團之間靜電吸引。 (2)二乙氨基乙基纖維素(DEAE-纖維素) 在中性pH條件下,它含有帶正電荷的基團,可與溶液中的帶負電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合,可交換的基團帶負電荷,因此是一種陰離子交換劑。當(dāng)某一蛋白質(zhì)混合溶液通過裝有DEAE-纖維素的層析柱時,帶正電荷的蛋白質(zhì)不能結(jié)合而隨著洗脫液的流動先被洗脫下來。帶負電荷的蛋白質(zhì)將被結(jié)合到柱上。結(jié)合力取決于彼此相反電荷基團間的靜電吸引。然后選用一定pH和離子強度的緩沖液進行洗脫,改變蛋白質(zhì)分子所帶的靜電荷,依次從層析柱流出達到相互分離的目的。
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.4 樣品的進一步分離純化 用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì),須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有:凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。 1. 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析(gel-filtration chromatography)又稱為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠(Sephadex)裝入一個柱子中,制成凝膠柱。這種凝膠顆粒具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),不同類型凝膠的網(wǎng)孔大小不同。當(dāng)把蛋白質(zhì)混合樣品加到凝膠柱中時,比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可進入網(wǎng)孔內(nèi),而大于網(wǎng)孔的分子則不能進入被排阻在凝膠顆粒之外。當(dāng)用洗脫液洗脫時,被排阻的分子量大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠之間的縫隙先被洗脫下來,而比網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可連續(xù)不斷地進入網(wǎng)孔內(nèi)。這樣的小分子不但流經(jīng)的路程長,而且受到來自凝膠內(nèi)部的阻力也很大,所以蛋白質(zhì)越小,從柱子上洗脫下來所需時間越長。由于不同蛋白質(zhì)的分子大小不同,進入網(wǎng)孔的程度不同,因此流出的速度不同,洗脫所用體積及時間不同,從而達到分離的目的。
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.4.3. 親和層析 親和層析(affinity-chromatography)分離技術(shù)是根據(jù)許多蛋白質(zhì)對特定的化學(xué)基團具有專一性結(jié)合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質(zhì)所識別并與之結(jié)合的基團稱為配基或配體(ligand)。親和層析是一種極有效的分離純化蛋白質(zhì)的方法。例如酶對它的底物具有特殊的親和力;抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A(concanavalin A)的分離純化為例,由于該蛋白對葡萄糖有專一性親和吸附,因此可把葡萄糖通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質(zhì)大分子與其配基的結(jié)合,在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂(或稱為間隔臂,spacerarm),使配體與載體之間保持足夠的距離。 將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱。當(dāng)含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部,并沿柱從上往下過時,待純化的蛋白質(zhì)與其特異性配基結(jié)合而被吸附到柱上,其他蛋白因不能與葡萄糖配基結(jié)合將通過柱子而流出(圖2-28a)。然后采用一定的洗脫條件,如濃的葡萄糖溶液進行洗脫,即可把該蛋白質(zhì)洗脫下來,達到與其它蛋白質(zhì)分離的目的。蛋白純化系統(tǒng)上門維修
蛋白純化系統(tǒng)上門維修
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.2 蛋白質(zhì)的抽提 通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑(十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等),使膜結(jié)構(gòu)破壞,利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過程中,應(yīng)注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質(zhì)的變性。 2.3蛋白質(zhì)粗制品的獲得 選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法: 1. 等電點沉淀法 不同蛋白質(zhì)的等電點不同,可用等電點沉淀法使它們相互分離。 2. 鹽析法 不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì),并能再度溶解而不變性。 3. 有機溶劑沉淀法 中性有機溶劑如乙醇、**,它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低,進而從溶液中沉淀出來,因此可用來沉淀蛋白質(zhì)。此外,有機溶劑會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層,促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質(zhì)變性,使用該法時,要注意在低溫下操作.蛋白純化系統(tǒng)上門維修
蘇州英賽斯智能科技有限公司致力于儀器儀表,是一家生產(chǎn)型公司。公司自成立以來,以質(zhì)量為發(fā)展,讓匠心彌散在每個細節(jié),公司旗下蛋白純化色譜系統(tǒng),凝膠凈化色譜系統(tǒng),制備液相色譜,柱塞泵深受客戶的喜愛。公司秉持誠信為本的經(jīng)營理念,在儀器儀表深耕多年,以技術(shù)為先導(dǎo),以自主產(chǎn)品為重點,發(fā)揮人才優(yōu)勢,打造儀器儀表良好品牌。在社會各界的鼎力支持下,持續(xù)創(chuàng)新,不斷鑄造***服務(wù)體驗,為客戶成功提供堅實有力的支持。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/2292383.html
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