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蛋白質(zhì)純化方法-親和層析親和層析法包括特異性配體親和層析法以及通用性配體親和層析法。比較這兩種親和層析法。特異性配體親和層析法通常將復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)作為配體,它的結(jié)合力比較大河吸附選擇性比較強(qiáng)。而通用性配體親和層析法通常將簡單的小分子物質(zhì)作為配體,因此,它具有低廉的成本,吸附容量比較高,通過對吸附和脫附條件的改善能夠使得層析的分辨率提高。原理親和層析的原理類似于酶-底物,***-受體與抗原-抗體等特異性反應(yīng)的機(jī)理。有一定的親和力在每對反應(yīng)物之間。與在酶與底物的反應(yīng)中,只有特異的底物才可以結(jié)合一定的酶,使復(fù)合物產(chǎn)生相同。在親和層析中,只有特異的配體才可以和一定的生命大分子有親和力,并且使復(fù)合物產(chǎn)生。親和層析配體呈固相,而酶與底物的反應(yīng)底物呈液相是它們的不同點(diǎn)。事實(shí)上,親和層析是在含有活化基團(tuán)的基質(zhì)M上以共價鍵的方式固化具有識別能力的配體L,將固相載體制作成功而固化后的配體束縛特異物質(zhì)的能力依然保持。所以當(dāng)在小層析柱裝入固相載體,浙江化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)制造廠家,浙江化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)制造廠家,使得欲分離的樣品在該柱經(jīng)過,浙江化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)制造廠家。此時,樣品中對配體有親和力的物質(zhì)S就能夠通過結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)、范德瓦爾力與靜電引力等作用在固相載體上吸附著。 浙江化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)制造廠家
蛋白質(zhì)分離純化步驟 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則: 大多數(shù)蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞中都是和核酸等生物分子結(jié)合在一起,而且每種類型的細(xì)胞都含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì)。許多蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)上有許多相似之處,所以蛋白質(zhì)的分離提純是一項(xiàng)復(fù)雜的工作。到目前為止,還沒有一**成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中提取出來。但是對于任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一種較合適的分離純化程序以獲得高純度的制品。且分離的關(guān)鍵步驟、基本手段還是共同的。 蛋白質(zhì)提純的目的是增加產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量,同時又要保持和提高產(chǎn)品的生物活性。因此,要分離純化某一種蛋白質(zhì),首先應(yīng)選擇一種含目的蛋白質(zhì)較豐富的材料。其次,應(yīng)設(shè)法避免蛋白質(zhì)變性,以制備有活性的蛋白質(zhì)。對于大多數(shù)蛋白質(zhì)來說,純化操作都是在0~4℃的低溫下進(jìn)行的。同時也應(yīng)避免過酸、過堿的條件以及劇烈的攪拌和振蕩。另外,還要設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和其它雜蛋白,從而達(dá)到增加純度和提高產(chǎn)量的目的。直銷蛋白純化系統(tǒng)制造廠家
三、蛋白質(zhì)分子量的測定 3.3 沉降法 沉降法又稱超速離心法。蛋白質(zhì)溶液在受到強(qiáng)大的離心力作用時,蛋白質(zhì)分子趨于下沉,沉降速度與蛋白質(zhì)分子的大小、密度和分子形狀有關(guān),也與溶劑的密度和粘度有關(guān)。蛋白質(zhì)顆粒在離心場中的沉降速度用每單位時間內(nèi)顆粒下沉的距離來表示。 在離心場中,蛋白質(zhì)分子所受到的凈離心力(離心力減去浮力)與溶劑的摩擦力平衡時,每單位離心場強(qiáng)度的沉降速度稱為沉降系數(shù)(Sedimentation Coefficient)。國際上采用Svedberg單位作為沉降系數(shù)的單位,用S表示,以紀(jì)念超速離心法的創(chuàng)始人,瑞典***的蛋白質(zhì)化學(xué)家T.Svedberg。一個Svedberg單位(或直接稱一個S)為1×10—13s。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)大約在1×10—13~200×10—13s范圍內(nèi),即1S~200S。
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 分離純化蛋白質(zhì)的一般程序 2.1 材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 分離提純某一種蛋白質(zhì)時,首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài),不喪失活性。所以要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。常用的破碎組織細(xì)胞的方法有: 1. 機(jī)械破碎法 這種方法是利用機(jī)械力的剪切作用,使細(xì)胞破碎。常用設(shè)備有,高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽等。 2. 滲透破碎法 這種方法是在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎。 3. 反復(fù)凍融法 生物組織經(jīng)凍結(jié)后,細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。這種方法簡單方便,但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。 4. 超聲波法 使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.4.3. 親和層析 親和層析(affinity-chromatography)分離技術(shù)是根據(jù)許多蛋白質(zhì)對特定的化學(xué)基團(tuán)具有專一性結(jié)合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質(zhì)所識別并與之結(jié)合的基團(tuán)稱為配基或配體(ligand)。親和層析是一種極有效的分離純化蛋白質(zhì)的方法。例如酶對它的底物具有特殊的親和力;抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A(concanavalin A)的分離純化為例,由于該蛋白對葡萄糖有專一性親和吸附,因此可把葡萄糖通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質(zhì)大分子與其配基的結(jié)合,在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂(或稱為間隔臂,spacerarm),使配體與載體之間保持足夠的距離。 將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱。當(dāng)含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部,并沿柱從上往下過時,待純化的蛋白質(zhì)與其特異性配基結(jié)合而被吸附到柱上,其他蛋白因不能與葡萄糖配基結(jié)合將通過柱子而流出(圖2-28a)。然后采用一定的洗脫條件,如濃的葡萄糖溶液進(jìn)行洗脫,即可把該蛋白質(zhì)洗脫下來,達(dá)到與其它蛋白質(zhì)分離的目的。四川專業(yè)蛋白純化系統(tǒng)上門安裝
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三、蛋白質(zhì)分子量的測定 3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量 蛋白質(zhì)在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子大小、所帶電荷的量以及分子形狀。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中加入了十二烷基***鈉(sodium dodecylsulfate,SDS)。SDS是一種陰離子去污劑,可使蛋白質(zhì)變性并解離成亞基。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品中加入SDS(一般加入量為0.1%)后,SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合,使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷,這些電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原來所帶的電荷量,因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異。所有結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的形狀近似于長的橢園棒,它們的短軸是恒定的,而長軸與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比。這樣,消除了蛋白質(zhì)之間原有的電荷和形狀的差異,電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。 進(jìn)行凝膠電泳時,常常用一種染料作前沿物質(zhì),蛋白質(zhì)分子在電泳中的移動距離和前沿物質(zhì)移動的距離之比值稱為相對遷移率,相對遷移率和分子質(zhì)量的對數(shù)成直線關(guān)系。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)和其相對遷移率作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將未知蛋白質(zhì)在同樣條件下電泳,根據(jù)測得的樣品相對遷移率,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上便可查出其分子量。浙江化學(xué)分析蛋白純化系統(tǒng)制造廠家
蘇州英賽斯智能科技有限公司總部位于吳江經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)聯(lián)楊路南側(cè)、龍橋路西側(cè),是一家機(jī)器人與自動化設(shè)備、機(jī)械電子設(shè)備的研發(fā)、生產(chǎn)、銷售及技術(shù)咨詢;光學(xué)檢測設(shè)備、光電產(chǎn)品研發(fā)、制造、銷售;實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、儀器儀表的研發(fā)、制造、銷售及提供相關(guān)的技術(shù)咨詢和售后服務(wù);自營和代理各類商品及技術(shù)的進(jìn)出口業(yè)務(wù)(限定企業(yè)經(jīng)營或禁止進(jìn)出口的商品和技術(shù)除外)。(依法需經(jīng)批準(zhǔn)的項(xiàng)目,經(jīng)相關(guān)部門批準(zhǔn)后方可開展經(jīng)營活動)的公司。英賽斯深耕行業(yè)多年,始終以客戶的需求為向?qū)?,為客戶提?**的蛋白純化色譜系統(tǒng),凝膠凈化色譜系統(tǒng),制備液相色譜,柱塞泵。英賽斯不斷開拓創(chuàng)新,追求出色,以技術(shù)為先導(dǎo),以產(chǎn)品為平臺,以應(yīng)用為重點(diǎn),以服務(wù)為保證,不斷為客戶創(chuàng)造更高價值,提供更優(yōu)服務(wù)。英賽斯始終關(guān)注自身,在風(fēng)云變化的時代,對自身的建設(shè)毫不懈怠,高度的專注與執(zhí)著使英賽斯在行業(yè)的從容而自信。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/2306304.html
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