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蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.4.2 纖維素柱層析法 該法是利用蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)作為分離的基礎(chǔ)。離子交換纖維素(cellulose ion-exchanger)是人工合成的纖維素衍生物,它具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),有較大的表面積,江蘇蛋白純化系統(tǒng)上門維修,使蛋白質(zhì)大分子可以自由通過。因此常用于蛋白質(zhì)的分離,江蘇蛋白純化系統(tǒng)上門維修,江蘇蛋白純化系統(tǒng)上門維修。 (1)羧甲基纖維素(CM-纖維素) 在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團。在中性pH條件下,羧甲基上的質(zhì)子可解離下來(圖2-27a),而溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負電荷結(jié)合??山粨Q的基團帶正電,因此是一種陽離子交換劑。蛋白質(zhì)與離子交換纖維素之間結(jié)合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團之間靜電吸引。 (2)二乙氨基乙基纖維素(DEAE-纖維素) 在中性pH條件下,它含有帶正電荷的基團,可與溶液中的帶負電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合,可交換的基團帶負電荷,因此是一種陰離子交換劑。當某一蛋白質(zhì)混合溶液通過裝有DEAE-纖維素的層析柱時,帶正電荷的蛋白質(zhì)不能結(jié)合而隨著洗脫液的流動先被洗脫下來。帶負電荷的蛋白質(zhì)將被結(jié)合到柱上。結(jié)合力取決于彼此相反電荷基團間的靜電吸引。然后選用一定pH和離子強度的緩沖液進行洗脫,改變蛋白質(zhì)分子所帶的靜電荷,依次從層析柱流出達到相互分離的目的。江蘇蛋白純化系統(tǒng)上門維修
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.4.3. 親和層析 親和層析(affinity-chromatography)分離技術(shù)是根據(jù)許多蛋白質(zhì)對特定的化學基團具有專一性結(jié)合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質(zhì)所識別并與之結(jié)合的基團稱為配基或配體(ligand)。親和層析是一種極有效的分離純化蛋白質(zhì)的方法。例如酶對它的底物具有特殊的親和力;抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A(concanavalin A)的分離純化為例,由于該蛋白對葡萄糖有專一性親和吸附,因此可把葡萄糖通過適當?shù)幕瘜W反應(yīng)共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質(zhì)大分子與其配基的結(jié)合,在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂(或稱為間隔臂,spacerarm),使配體與載體之間保持足夠的距離。 將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱。當含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部,并沿柱從上往下過時,待純化的蛋白質(zhì)與其特異性配基結(jié)合而被吸附到柱上,其他蛋白因不能與葡萄糖配基結(jié)合將通過柱子而流出(圖2-28a)。然后采用一定的洗脫條件,如濃的葡萄糖溶液進行洗脫,即可把該蛋白質(zhì)洗脫下來,達到與其它蛋白質(zhì)分離的目的。江蘇蛋白純化系統(tǒng)上門維修
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 2.2 蛋白質(zhì)的抽提 通常選擇適當?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑(十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等),使膜結(jié)構(gòu)破壞,利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過程中,應(yīng)注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質(zhì)的變性。 2.3蛋白質(zhì)粗制品的獲得 選用適當?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法: 1. 等電點沉淀法 不同蛋白質(zhì)的等電點不同,可用等電點沉淀法使它們相互分離。 2. 鹽析法 不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì),并能再度溶解而不變性。 3. 有機溶劑沉淀法 中性有機溶劑如乙醇、**,它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低,進而從溶液中沉淀出來,因此可用來沉淀蛋白質(zhì)。此外,有機溶劑會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層,促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質(zhì)變性,使用該法時,要注意在低溫下操作.
蛋白質(zhì)分離純化步驟(二) 分離純化蛋白質(zhì)的一般程序 2.1 材料的預處理及細胞破碎 分離提純某一種蛋白質(zhì)時,首先要把蛋白質(zhì)從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài),不喪失活性。所以要采用適當?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有: 1. 機械破碎法 這種方法是利用機械力的剪切作用,使細胞破碎。常用設(shè)備有,高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。 2. 滲透破碎法 這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。 3. 反復凍融法 生物組織經(jīng)凍結(jié)后,細胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便,但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。 4. 超聲波法 使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破壞微生物細胞等。
實驗室及中試放大規(guī)模蛋白純化系統(tǒng) Unique Autopure系列蛋白純化系統(tǒng) 主要應(yīng)用領(lǐng)域 : – 蛋白純化系統(tǒng)主要應(yīng)用于單抗、重組蛋白、疫苗、生化 藥、、天然產(chǎn)物和多糖等生物制藥領(lǐng)域。用于生物制品的下游工藝的分離純化。 Unique AutoPure 系列蛋白純化系統(tǒng) : 產(chǎn)品特點及優(yōu)勢: – 模塊化設(shè)計,提供多個配置,滿足特殊工藝流程需求 - 低脈動高精度雙柱塞輸液泵 ,保證優(yōu)異的分離重現(xiàn)性 ; – 全系統(tǒng)與液體接觸的地方均由生物兼容性材料組成、符合FDA、USP VI等相關(guān)法規(guī)要求 ; – DAD全譜直讀檢測器,避免了傳統(tǒng)的機械切換式檢測器所帶來的不穩(wěn)定性及高故障率 ; – 固定波長檢測器燈為長壽命LED燈,壽命大于8000小時,降低維護成本 ; – **技術(shù)紫外檢測器流通池,低死體積、低峰拓展,提高了色譜分離度 ; – 高靈敏度在線pH、電導率、紫外檢測器,低死體積、低峰拓展,提高了色譜分離度 ; – 集中了buffer選擇閥,自動進樣閥、柱位閥等自動化組件,提高了純化的自動化程度 ; – 具有柱前、柱后、壓差報警,氣泡傳感器檢測等功能,極大的保護了系統(tǒng)及層析柱的安全性 ; – 層析工作站軟件是一款功能強大、性能先進、高穩(wěn)定性的色譜數(shù)據(jù)管理系北京化學分析蛋白純化系統(tǒng)
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蛋白質(zhì)純化方法-親和層析親和層析法包括特異性配體親和層析法以及通用性配體親和層析法。比較這兩種親和層析法。特異性配體親和層析法通常將復雜的生命大分子物質(zhì)作為配體,它的結(jié)合力比較大河吸附選擇性比較強。而通用性配體親和層析法通常將簡單的小分子物質(zhì)作為配體,因此,它具有低廉的成本,吸附容量比較高,通過對吸附和脫附條件的改善能夠使得層析的分辨率提高。原理親和層析的原理類似于酶-底物,***-受體與抗原-抗體等特異性反應(yīng)的機理。有一定的親和力在每對反應(yīng)物之間。與在酶與底物的反應(yīng)中,只有特異的底物才可以結(jié)合一定的酶,使復合物產(chǎn)生相同。在親和層析中,只有特異的配體才可以和一定的生命大分子有親和力,并且使復合物產(chǎn)生。親和層析配體呈固相,而酶與底物的反應(yīng)底物呈液相是它們的不同點。事實上,親和層析是在含有活化基團的基質(zhì)M上以共價鍵的方式固化具有識別能力的配體L,將固相載體制作成功而固化后的配體束縛特異物質(zhì)的能力依然保持。所以當在小層析柱裝入固相載體,使得欲分離的樣品在該柱經(jīng)過。此時,樣品中對配體有親和力的物質(zhì)S就能夠通過結(jié)構(gòu)互補效應(yīng)、范德瓦爾力與靜電引力等作用在固相載體上吸附著。 江蘇蛋白純化系統(tǒng)上門維修
蘇州英賽斯智能科技有限公司是一家機器人與自動化設(shè)備、機械電子設(shè)備的研發(fā)、生產(chǎn)、銷售及技術(shù)咨詢;光學檢測設(shè)備、光電產(chǎn)品研發(fā)、制造、銷售;實驗室設(shè)備、儀器儀表的研發(fā)、制造、銷售及提供相關(guān)的技術(shù)咨詢和售后服務(wù);自營和代理各類商品及技術(shù)的進出口業(yè)務(wù)(限定企業(yè)經(jīng)營或禁止進出口的商品和技術(shù)除外)。(依法需經(jīng)批準的項目,經(jīng)相關(guān)部門批準后方可開展經(jīng)營活動)的公司,致力于發(fā)展為創(chuàng)新務(wù)實、誠實可信的企業(yè)。英賽斯作為機器人與自動化設(shè)備、機械電子設(shè)備的研發(fā)、生產(chǎn)、銷售及技術(shù)咨詢;光學檢測設(shè)備、光電產(chǎn)品研發(fā)、制造、銷售;實驗室設(shè)備、儀器儀表的研發(fā)、制造、銷售及提供相關(guān)的技術(shù)咨詢和售后服務(wù);自營和代理各類商品及技術(shù)的進出口業(yè)務(wù)(限定企業(yè)經(jīng)營或禁止進出口的商品和技術(shù)除外)。(依法需經(jīng)批準的項目,經(jīng)相關(guān)部門批準后方可開展經(jīng)營活動)的企業(yè)之一,為客戶提供良好的蛋白純化色譜系統(tǒng),凝膠凈化色譜系統(tǒng),制備液相色譜,柱塞泵。英賽斯始終以本分踏實的精神和必勝的信念,影響并帶動團隊取得成功。英賽斯創(chuàng)始人李大為,始終關(guān)注客戶,創(chuàng)新科技,竭誠為客戶提供良好的服務(wù)。
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