是分泌性蛋白檢測優(yōu)先方法之一，江蘇七色免疫組化。下面介紹下免疫組化方法的具體實驗流程步驟。實驗流程簡介一、SP三步法1）石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。2)（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內源性過氧化物酶活性。3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘4）候選步驟：采用抗原修復：微波（建議30分鐘內4次中火）、高壓、酶修復方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，江蘇七色免疫組化，勿洗。6）滴加適當比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時或4℃過夜（比較好復溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。7）滴加生物素標記的二抗，室溫或37℃孵育30分鐘-1h。8)PBS沖洗，3分鐘×5次。9）滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。10)PBS沖洗，3分鐘×5次。11）顯色劑顯色（DAB等）。12）自來水充分沖洗。13）可進行復染，脫水，透明。14）選擇適當?shù)姆馄瑒┓馄?。二、即用型二步?）脫蠟、水化組織切片。2）根據(jù)所應用的一抗的特殊要求，江蘇七色免疫組化，對組織切片進行預處理。3)，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS或TBS沖洗。4）滴加一抗，室溫或37℃孵育30~60分鐘，或4℃過夜，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。5）滴加enhangcer增強劑，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。江蘇七色免疫組化

    問題及其解答：產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？1、抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是**重要的一條。2、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。3、內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；4、非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；5、DAB孵育時間過長或濃度過高；6、PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要；7、標本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。我的實際解決方案：以上的分析可能對于初學者還是不容易的，下面我就把我的排除實驗的具體過程與大家進行分享、交流和討論。1、首先排除抗體孵育條件。一般來說，著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的，由于用SP法已經(jīng)做出來過一次且效果不錯，因此對于同樣組織的同一抗原進行分析，這種因素可以先排除。2、其次，DAB孵育時間是否太長？做出來那一次我是孵育8min，后來也是8-10min。江蘇七色免疫組化

多重熒光免疫組化染色技術

免疫組化染色是一種研究組織形態(tài)和原位蛋白表達的常見技術，隨著免疫zhiliao的崛起，越來越多**微環(huán)境種的標志物被發(fā)現(xiàn)與疾病zhiliao、進展密切相關，對這些標志物進行同時染色標記、并研究它們之間的共定位、表達量和距離關系成為**免疫研究的普遍需求。

酪氨信號放大技術原理

類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色法，TSA（Tyramide signal amplification）技術同樣采用HRP標記的二抗，HRP催化加入體系的熒光素底物，生成活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸共價結合，使樣品上穩(wěn)定地共價結合熒光素。之后用熱修復洗去非共價結合的抗體，再換下一種一抗來第二輪孵育，換另一種熒光素底物，如此往復就可實現(xiàn)多重標記。

    因而它是大多數(shù)免疫組化中優(yōu)先的組織標本制作方法。1、取材的特殊要求及注意事項·標本新鮮：一般在2h以內進行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴重彌散?！と〔牟课唬撼〔≡罨蚝龣z抗原部位外，還應取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時應有抗原陽性和陰性區(qū)，以形成自身對照。–細胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時應盡可能避開壞死區(qū)。1、取材的特殊要求及注意事項(續(xù))·避免擠壓：取材時組織受擠壓可使邊緣部細胞形態(tài)改變并加深非特異著色，因而取材時應使用鋒利的刀刃；–鑷取組織動作要輕；–經(jīng)窺鏡直接鉗取的組織往往有過度擠壓，觀察結果時應有所考慮。2、固定及常用的固定液·取材后的組織需立刻投于固定劑中–固定使組織和細胞的蛋白質凝固，終止內源性或外源性酶反應，防止組織自溶或異溶，以保持原有結構和形態(tài)；–對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散?！こＳ霉潭ㄒ海汗潭▌┢贩N很多，但大多屬于醛類和醇類。其固定原理不同，各有優(yōu)缺點。–醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）–醇類（常用乙醇）–其它（**）(1)醛類·甲醛。

    6）滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，室溫/37℃孵育30分鐘-1h，PBS/TBS沖洗，3分鐘×5次。7）應用DAB溶液顯色。8）蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明、封片。三、免疫熒光技術（略）1、酶免疫組化的關鍵環(huán)節(jié)1）標本固定固定的目的是①防止標本從玻片上脫落；②除去妨礙抗原-抗體結合的類脂，使抗原抗體結合物易于獲得良好的染色結果；③固定的標本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛，但睪丸組織、眼可能要選用Bouin’s液或mDF液效果較好。2）脫水、石蠟包埋和制片脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對組織要完全浸蠟、切片時刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。3）脫蠟和水化這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結合反應。脫蠟可以先60℃20min，然后立即二甲苯1-3分別10min（這個時間是由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定的），但當天制好的切片一般先60℃3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。4）抗原修復由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露。天津五色免疫組化技術服務

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