比較Ct值的相對定量法：此方法是將待測靶基因片段和內(nèi)參照基因片段同時擴增，可以在兩個反應(yīng)管中或者一個反應(yīng)管中進行擴增反應(yīng)，并且就兩者的ct值之差進行測量，北京轉(zhuǎn)基因熒光定量PCR檢測服務(wù)。在采用此方法過程中需要用數(shù)學(xué)公式進行相對量的計算，北京轉(zhuǎn)基因熒光定量PCR檢測服務(wù)，首先要假設(shè)每個循環(huán)產(chǎn)物增加一倍時PCR反應(yīng)**期得到Ct值對起始模板的量一個循環(huán)的估算和起始模板數(shù)兩倍相當(dāng)。這種方法的前提是靶基因和內(nèi)源控制物的擴增效率基本一致，北京轉(zhuǎn)基因熒光定量PCR檢測服務(wù)，所以在應(yīng)用過程中效率的偏移會對實際拷貝數(shù)估計產(chǎn)生一定影響，因此，為了保證目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率相等應(yīng)當(dāng)加強對反應(yīng)體系的優(yōu)化，這也是該方法應(yīng)用的難點之一北京轉(zhuǎn)基因熒光定量PCR檢測服務(wù)

熒光定量PCR實驗步驟：

  取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

  兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

  RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。 北京轉(zhuǎn)基因熒光定量PCR檢測服務(wù)

純度檢測

  RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

  變性瓊脂糖凝膠電泳測定

  制膠

  1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

  灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

  準(zhǔn)備RNA樣品

  取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

  電泳

  上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。

  紫外透射光下觀察并拍照

實時熒光定量PCR的應(yīng)用

目前，qPCR技術(shù)已經(jīng)***應(yīng)用于生物醫(yī)藥食品等行業(yè)，應(yīng)用于疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、***研究、**的診斷與研究、食品病原微生物的檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、動物疫病檢測等，除此之外，還包括：

● 基因擴增

● 擴增特異性分析

● 基因定量分析

● 基因檢測

● 基因分型

● SNP分析

● RFLP多態(tài)性分析

● 單/多基因表達研究

● 高通量基因表達譜研究

實時熒光定量PCR技術(shù)，顧名思義，就是在PCR的基礎(chǔ)上加入熒光基團，通過熒光信號的變化的實時監(jiān)測PCR的反應(yīng)過程，***通過對未知模板進行定量分析的方法。

RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。

  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

  溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用***反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定

  先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。 北京轉(zhuǎn)基因熒光定量PCR檢測服務(wù)

北京轉(zhuǎn)基因熒光定量PCR檢測服務(wù)

使用包含 3 種不同濃度的 ROX 染料的預(yù)混液對 TGF-β 進行擴增。顯示 (A) Ct 值和 (B) 標(biāo)準(zhǔn)差隨 ROX 染料濃度的變化。降低 ROX 染料濃度導(dǎo)致 Ct 出現(xiàn)得更早，但是會增大標(biāo)準(zhǔn)差。使用 Applied Biosystems 7500 實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)執(zhí)行所有擴增。

Ct 隨 PCR 效率發(fā)生變化。藍色標(biāo)準(zhǔn)曲線的效率為 **（斜率為 –3.3）。綠色標(biāo)準(zhǔn)曲線的效率為 78%（斜率為 –4）。與高效率條件相比（藍色），在低效率條件下（綠色），擴增量 Y 使 Ct 出現(xiàn)得更早。較低擴增量 (X) 時則情況相反，與高效率條件（藍色）相比，低效率條件（綠色）使 Ct 出現(xiàn)得更晚。 北京轉(zhuǎn)基因熒光定量PCR檢測服務(wù)

上海朝瑞生物科技有限公司創(chuàng)建于2003-01-22，注冊資金 700-1000萬元，是一家專注1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實驗室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù)的公司。目前我公司在職員工達到5~10人人，是一個有活力有能力有創(chuàng)新精神的高效團隊。公司業(yè)務(wù)范圍主要包括：[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]等。公司奉行顧客至上、質(zhì)量為首、的經(jīng)營宗旨，深受客戶好評。目前公司已經(jīng)成為[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]的**企業(yè)，正積蓄著更大的能量，向更廣闊的空間、更***的領(lǐng)域拓展。

文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/254257.html