熒光定量PCR 實驗步驟（1） 

樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細胞，北京熒光定量PCR檢測服務，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

②每樣品加入1ml的TRIZOL試劑裂解，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，北京熒光定量PCR檢測服務，先加入無RNA酶的水40μl用移液器反復吹打幾次，北京熒光定量PCR檢測服務，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 北京熒光定量PCR檢測服務

在PCR擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標記一個報告熒光基團，3’端標記一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。

在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號**擴增階段任意位置上，但一般熒光閾值的設置是PCR反應**-15個循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍。 北京熒光定量PCR檢測服務

無論 Ct ***值是多少，任何能夠有效擴增和檢測起始模板拷貝數為 1 的系統(tǒng)都達到了靈敏度的極限。

如前文所述，效率是決定反應靈敏度的關鍵因素（圖 5）。在檢測極低拷貝數時的另一個重要的考慮因素是，不能預期模板為正態(tài)分布。相反，它會遵循泊松分布，該分布預測在平均包含一個拷貝的起始模板的大量重復中，實際上約 37% 不含拷貝，*有約 37% 含有 1 個拷貝，18% 應包含 2 個拷貝（見圖 9）。因此，為了可靠地檢測低拷貝，必須做大量的重復實驗來提供統(tǒng)計***性，以克服泊松分布的限制。

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）指的是在PCR進行的同時，對其過程進行監(jiān)測的能力（即實時）。因此，數據可在PCR擴增過程中，而非PCR結束之后，進行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了**性的變革。在實時熒光定量PCR (qPCR)中，反應以循環(huán)中***檢測到目標擴增的時間點為特征，而非在一定循環(huán)數后目標分子累計的擴增量。目標核酸的起始拷貝數越高，則會越快觀察到熒光的***增加。相反，終點法檢測（也稱 “讀板檢測”）測量的是PCR循環(huán)結束時累計的PCR產物量。

實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）技術是在PCR技術的基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術，它是通過在PCR反應體系中加入熒光基團，然后利用熒光信號的積累強弱實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線對未知的DNA模板進行定量，實現了PCR從定性到定量的飛躍，為快速準確地分析樣本中的各類待檢物質提供了嶄新的技術工具，現在已被***應用于實驗室及臨床**標志物的檢測。Real-Time PCR與傳統(tǒng)的PCR技術相比其使用了熒光探針標記特定核酸從而提高了準確性；靈敏度提高故使用較少的樣本量，從而減少了樣本消耗殆盡的風險，在一小時左右即可出結果，簡化了傳統(tǒng)PCR方法；全封閉管分析、利用電腦分析軟件對PCR擴增產物的實時動態(tài)的檢測和自動定量，定量動態(tài)范圍高達五個數量級，且結果重現性較好，這也提高了檢測的靈敏度和精密度。 北京基因表達熒光定量PCR檢測服務

北京熒光定量PCR檢測服務

混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。

  取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。 管家基因(β-actin)實時定量PCR

  β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。

  反應體系如下：

  標準品反應體系 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 陽性模板上游引物F 0.5μl 3 陽性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 陽性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 北京熒光定量PCR檢測服務

上海朝瑞生物科技有限公司創(chuàng)建于2003-01-22，注冊資金 700-1000萬元，是一家專注1.發(fā)布科研技術 2.發(fā)布應用技術 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務 8.發(fā)布升級改造產品服務 9.發(fā)布實驗室及儀器設備共享 10.發(fā)布培訓基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務 15.發(fā)布資源交換業(yè)務的公司。目前我公司在職員工達到5~10人人，是一個有活力有能力有創(chuàng)新精神的高效團隊。公司業(yè)務范圍主要包括：[ "科研技術服務", "應用技術服務", "科研成果轉化", "科學產品銷售" ]等。公司奉行顧客至上、質量為首、的經營宗旨，深受客戶好評。目前公司已經成為[ "科研技術服務", "應用技術服務", "科研成果轉化", "科學產品銷售" ]的**企業(yè)，正積蓄著更大的能量，向更廣闊的空間、更***的領域拓展。

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