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形成抗原抗體復(fù)合物,再用二抗(酶標(biāo)抗體)與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合,形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,***用底物顯色劑顯色。酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟·標(biāo)本準(zhǔn)備:–石蠟脫蠟至水;–冰凍切片浸入4?C**固定10min,PBST漂洗,5min×3;–細(xì)胞爬片先用PBS洗,然后4?C**固定10min,再PBST漂洗,5min×3;·石蠟切片需要進(jìn)行抗原修復(fù),其它標(biāo)本則不用;(2)酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟(續(xù))·封閉內(nèi)源性過氧化物酶:3%H2O2-甲醇溶液室溫孵育5~10min(濕盒內(nèi));·PBST漂洗,5min×3;·5~10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育30min(濕盒內(nèi));·傾去血清勿洗,加1%BSA(PBST配制)稀釋的一抗,37?C孵育60min或4?C過夜(濕盒內(nèi));(2)酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟(續(xù))·PBST漂洗,5min×3;·加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育lh或37?C30min;·加(顯色液應(yīng)新鮮配置);·經(jīng)PBS漂洗3次后,梯度酒精脫水,二甲苯透明,北京七色免疫組化染色服務(wù),明膠甘油封片,顯微鏡觀察,北京七色免疫組化染色服務(wù)。(2)非標(biāo)記抗體酶法——酶橋法·首先用酶免疫動物,制備效價高,北京七色免疫組化染色服務(wù)、特異性強(qiáng)的抗酶抗體;·以二抗作橋,將抗酶抗體聯(lián)結(jié)在一抗上;·再將酶結(jié)合在抗酶抗體上,經(jīng)顯色顯示抗原的分布–優(yōu)點(diǎn):任何抗體均未被酶標(biāo)記。酶是通過免疫學(xué)原理與酶抗體結(jié)合的。北京七色免疫組化染色服務(wù)
為了在同一張組織切片或細(xì)胞學(xué)涂片上同時或先后顯示兩種或兩種以上的抗原,發(fā)展了雙重和多重免疫組化技術(shù)。這對于在原位了解不同抗原的關(guān)系,將形態(tài)與功能相結(jié)合極為有用。
近年來,雙重標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了免疫組化和核酸分子雜交技術(shù),已跨越蛋白質(zhì)水平,進(jìn)入DNA、RNA水平,可在同一細(xì)胞內(nèi)顯示兩種不同的DNA或mRNA,或者顯示DNA和蛋白質(zhì)。也有人以放射性同位素標(biāo)記和酶組織化學(xué)結(jié)合來顯示靶DNA和抗原。雙重染色的基本方法有雙重?zé)晒夂碗p重酶標(biāo)記法。雙重?zé)晒鈽?biāo)記**常用的是FITC和TMRITC或RB200,雙重酶標(biāo)記常用的是辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。
江蘇五色免疫組化染色服務(wù)在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測系統(tǒng)等。3)免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠,它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白,對蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此,用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針,就能對組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位,甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒,且膠體金的電子密度高,所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色,因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。5、被檢測的物質(zhì)組織或細(xì)胞中凡是能作為抗原或半抗原,如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、***、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測。6、特點(diǎn)1)特異性強(qiáng)免疫學(xué)的基本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性,因此,免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示,如角蛋白(keratin)顯示上皮成分,LCA顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時,才會出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2)敏感性高在應(yīng)用免疫組化的起始階段。
80年代到90年代相繼又有新的熒光素出現(xiàn)如R-藻紅朊、B-藻紅朊、C-藻青蛋白、cy2、cy3、cy5和cy7等均在流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡中廣泛應(yīng)用。由于免疫熒光組織化學(xué)的特異性,快速性和在細(xì)胞水平定位的準(zhǔn)確性,已在免疫學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、**學(xué)以及臨床檢驗(yàn)等許多方面得到廣泛應(yīng)用,日益發(fā)揮重要作用。[1]免疫組織化學(xué)技術(shù)現(xiàn)狀與展望編輯免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)經(jīng)過半個多世紀(jì)的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新,已成為現(xiàn)代研究生物和醫(yī)學(xué)的重要手段之一。由于免疫熒光技術(shù)與形態(tài)、機(jī)能相結(jié)合不斷完善和發(fā)展,尤其是合成了多種新熒光素與抗體容易結(jié)合,且結(jié)合物穩(wěn)定。可以和FITC結(jié)合進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)記或三標(biāo)記。至今,它已和親合化學(xué)技術(shù)如SPA、Biotin以及avidin、ConA相結(jié)合,應(yīng)用領(lǐng)域也日益擴(kuò)大,又與現(xiàn)代的電子計算機(jī)、掃描電鏡技術(shù)、共聚焦顯微鏡、熒光***細(xì)胞分類器(FACS)以及數(shù)碼相機(jī)攝影技術(shù)的應(yīng)用,使得快速性、簡便性有了更大的提高,使得定量更加準(zhǔn)確。90年代又開展了熒光原位末端標(biāo)記和熒光原位雜交技術(shù),使得應(yīng)用范圍更廣。雖然免疫組織化學(xué)技術(shù)有了很大的發(fā)展,如免疫金銀法、免疫膠體金法、SP、Evision二步法和CSA法,但由于它有自己獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):特異性強(qiáng)。
實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類,前者包括石蠟切片(病理切片和組織芯片)和冰凍切片,后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本**常用、**基本的方法,對于組織形態(tài)保存好,且能作連續(xù)切片,有利于各種染色對照觀察;還能長期存檔,供回顧性研究;石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響,但可進(jìn)行抗原修復(fù),是免疫組化中優(yōu)先的組織標(biāo)本制作方法??贵w免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體,單克隆抗體是一個B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體,應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后,從動物血中所獲得的免疫血清,是多個B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。北京七色免疫組化染色服務(wù)
北京七色免疫組化染色服務(wù)
時間過長,會使熒光減弱?!っ看卧囼?yàn)時,需設(shè)置以下三種對照:–陽性對照:陽性血清+熒光標(biāo)記物–陰性對照:陰性血清+熒光標(biāo)記物–熒光標(biāo)記物對照:PBS+熒光標(biāo)記物?間接免疫熒光法的注意事項(xiàng)(續(xù))·標(biāo)本片需在操作的各個步驟中,始終保持濕潤,避免干燥?!ひ豢购投箲?yīng)始終保持在標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫酶酶標(biāo)法【原理】·以酶作為標(biāo)記物與外加底物作用后產(chǎn)生不溶性色素,沉積于抗原和抗體反應(yīng)的部位;·酶降解底物的量與色澤濃度成正比??煞从潮粶y定的抗原或抗體的量。1、常用的標(biāo)記酶及其顯色底物·辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)及底物·堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)及底物(1)辣根過氧化物酶(HRP)及底物·HRP是應(yīng)用**廣的一種酶,來源于植物辣根,由無色的酶蛋白和深棕色的鐵葉琳結(jié)合而成,分子量約40kDa,穩(wěn)定性好;·底物為過氧化物和供氫體(DH2)–過氧化物:常用過氧化氫和過氧化氫尿素。–供氫體:多用無色的還原型染料,通過反應(yīng)生成有色的氧化型染料,**常用的供氫體是DAB。DAB(二氨基聯(lián)苯胺)·DAB本身無色,反應(yīng)后呈棕色,不溶于水,不易褪色,電子密度高,**為常用。北京七色免疫組化染色服務(wù)
上海朝瑞生物科技有限公司始建于2003-01-22,坐落于上海市松江區(qū)廣富林路697號昂立大廈2113室,現(xiàn)有員工5~10人余人。在上海朝瑞科技近多年發(fā)展歷史,公司旗下現(xiàn)有品牌zrbiorise,SPRICELL,scienceladde等。公司不**提供專業(yè)的1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗(yàn)檢測服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實(shí)驗(yàn)室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項(xiàng)目團(tuán)隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項(xiàng)目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù),同時還建立了完善的售后服務(wù)體系,為客戶提供質(zhì)量的產(chǎn)品和服務(wù)。上海朝瑞科技始終以質(zhì)量為發(fā)展,把顧客的滿意作為公司發(fā)展的動力,致力于為顧客帶來***的[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]。
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