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為了便于新發(fā)或罕見病毒性傳染病的篩查檢測,利用多重置換擴(kuò)增技術(shù),以負(fù)鏈RNA病毒—發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒和正鏈RNA病毒—登革病毒為模擬樣本探索臨床樣本中RNA病毒基因組非特異性擴(kuò)增方法。研究中通過梯度稀釋的RNA病毒模擬樣本中可能存在的不同豐度的病原體,樣本核酸依次加工成單鏈cDNA,雙鏈cDNA,RNA病毒高通量測序技術(shù),T4DNA連接酶處理后的雙鏈cDNA以及添加外源輔助RNA后合成并連接的雙鏈cDNA形式,然后進(jìn)行Phi29DNA聚合酶等溫?cái)U(kuò)增,RNA病毒高通量測序技術(shù),使用熒光定量PCR方法比較各種方法對RNA病毒核酸擴(kuò)增的影響,RNA病毒高通量測序技術(shù)。一般是用密集的sanger測序監(jiān)測某幾個(gè)關(guān)鍵基因,搭載一定頻率的全基因組測序。RNA病毒高通量測序技術(shù)
全基因組測序是對未知基因組序列的物種進(jìn)行個(gè)體的基因組測序。 技術(shù)路線:提取基因組DNA,然后隨機(jī)打斷,電泳回收所需長度的DNA的片段(0.2~5Kb),加上接頭, 進(jìn)行DNA簇(Cluster)制備,后利用Paired-End(Solexa)或者M(jìn)ate-Pair(SOLiD)的方法對插入片段進(jìn)行測序。然后對測得的序列組裝成Contig,通過Paired-End的距離可進(jìn)一步組裝成Scaffold,進(jìn)而可組裝成染色體等。組裝效果與測序深度與覆蓋度、測序質(zhì)量等有關(guān)。常用的組裝有:SOAPdenovo、Trimity、Abyss等。測序深度(Sequencing depth)是指測序得到的堿基總量(bp)與基因組大小的比值,它是評價(jià)測序量的指標(biāo)之一。測序深度與基因組覆蓋度之間是一個(gè)正相關(guān)的關(guān)系,測序帶來的錯(cuò)誤率或假陽性結(jié)果會(huì)隨著測序深度的提升而下降。測序的個(gè)體,如果采用的是雙末端或Mate-Pair方案,當(dāng)測序深度在50X~100X以上時(shí),基因組覆蓋度和測序錯(cuò)誤率控制均得以保證,后續(xù)序列組裝成染色體才能變得更容易與準(zhǔn)確。廣州病毒序列測序方法比較基因組學(xué)層面可通過差異分析、同源基因分析、共線性分析、物種進(jìn)化分析等手段探究病毒的毒力系統(tǒng)。
二代測序用于對病毒的全基因組進(jìn)行測序有哪些挑戰(zhàn)?二代測序相較sanger測序,差異主要就是單次運(yùn)行可以獲得海量的數(shù)據(jù)量,因此也稱為高通量測序。想要通過高通量測序獲得病毒全序列,需要經(jīng)歷:核酸純化-文庫構(gòu)建-生物信息學(xué)分析這三大基本流程。而高通量測序技術(shù)本身并不是以病毒為目標(biāo)開發(fā)的,因此每個(gè)環(huán)節(jié)都是挑戰(zhàn)。核酸純化步驟決定了Input核酸的起始濃度和總量,從而決定了文庫構(gòu)建的成敗、質(zhì)量和產(chǎn)量;文庫的好壞決定了數(shù)據(jù)的質(zhì)量和產(chǎn)出;而數(shù)據(jù)的質(zhì)量產(chǎn)出直接影響分析結(jié)果。樣品一般核酸濃度很低,且?guī)в写罅克拗魑廴?,因此?shí)驗(yàn)部分和分析部分都比較困難。探普生物基于這些困難點(diǎn),進(jìn)行了大量有針對性的研發(fā)和測試,開發(fā)了全套的實(shí)驗(yàn)和分析流程用于對病毒的全基因組進(jìn)行測序,該流程自運(yùn)行以來廣受研究者們好評。
目前對我國首例輸入性裂谷熱病例病毒進(jìn)行全基因組測定,分析其進(jìn)化來源及潛在變異.方法 提取樣本核酸,非特異性反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增病毒基因組RNA,使用Ion Torrent二代測序儀進(jìn)行病毒全基因組測定.對獲得的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行序列拼接、比對、進(jìn)化樹構(gòu)建和關(guān)鍵位點(diǎn)分析.結(jié)果通過測定獲得了病毒全基因組11 979nt,該測定病毒屬E基因分支,序列與先前南非分離株Kakamas相似度較高(>98%).病毒Gn蛋白C端信號肽區(qū)存在1個(gè)氨基酸突變.結(jié)論本研究分析測定的裂谷熱病毒全基因組與目前非洲流行株高度相似,病毒基因特征未出現(xiàn)明顯變異。全基因組測序覆蓋面廣,能檢測個(gè)體基因組中的全部遺傳信息,準(zhǔn)確性高。
為什么發(fā)現(xiàn)病例的要盡快對病毒進(jìn)行全基因組測序呢?通過對病毒全基因組高通量測序可以在較短時(shí)間內(nèi)獲取病毒的全部基因信息,解釋病毒的來源、傳播、變異演化等科學(xué)問題,為后續(xù)流行病學(xué)調(diào)查指明方向,為相關(guān)病例的追蹤溯源提供重要依據(jù),目前對溯源分型主要檢測手段就是高通量測序技術(shù)。高通量測序技術(shù)如何進(jìn)行病毒溯源?先對獲得的早期病例標(biāo)本開展全基因組高通量序列測定,通過與本地流行病毒及全球其他地區(qū)測定過序列的病毒比較,如果該病例傳染的病毒在基因組上和北美流行株更接近,比如在全長接近3萬個(gè)堿基的序列上,兩者*相差幾個(gè)堿基,相似度為99%以上,這就是為我們推斷該病例攜帶病毒為北美流行株提供依據(jù)。DNA病毒基因組測序:獲得一種指定DNA病毒盡量完整的序列。廣州病毒序列測序方法
哪些應(yīng)用場景需要對病毒的全基因組進(jìn)行測序?RNA病毒高通量測序技術(shù)
未培養(yǎng)病毒基因組的信息標(biāo)準(zhǔn):①關(guān)于未培養(yǎng)病毒基因組標(biāo)準(zhǔn)的信息是在基因組標(biāo)準(zhǔn)框架內(nèi)制定的,包括病毒起源、基因組質(zhì)量、基因組注釋、分類信息、生物地理分布和宿主預(yù)測;②UViGs有助于提高我們對病毒進(jìn)化歷史和病毒-宿主之間相互作用的理解;③病毒基因組組成和內(nèi)容、復(fù)制策略和宿主的異常多樣性意味著UViGs的完整性、質(zhì)量、分類學(xué)和生態(tài)學(xué)需要通過病毒特異性指標(biāo)來評估;④分析不同大小和不同樣品類型的UViGs對于探索病毒基因組序列空白是有價(jià)值的 。RNA病毒高通量測序技術(shù)
上海探普生物科技有限公司總部位于放鶴路1088號6號樓307,是一家 從事生物科技專業(yè)領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)開發(fā)、技術(shù)轉(zhuǎn)讓、技術(shù)咨詢、技術(shù)服務(wù),化工原料及產(chǎn)品(除危險(xiǎn)化學(xué)品、監(jiān)控化學(xué)品、煙花爆竹、民用物品、易制毒化學(xué)品),實(shí)驗(yàn)室設(shè)備,計(jì)算機(jī)、軟件及輔助設(shè)備,電子產(chǎn)品銷售,計(jì)算機(jī)軟件開發(fā)及維護(hù),計(jì)算機(jī)信息系統(tǒng)集成服務(wù)等。的公司。上海探普生物作為 從事生物科技專業(yè)領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)開發(fā)、技術(shù)轉(zhuǎn)讓、技術(shù)咨詢、技術(shù)服務(wù),化工原料及產(chǎn)品(除危險(xiǎn)化學(xué)品、監(jiān)控化學(xué)品、煙花爆竹、民用物品、易制毒化學(xué)品),實(shí)驗(yàn)室設(shè)備,計(jì)算機(jī)、軟件及輔助設(shè)備,電子產(chǎn)品銷售,計(jì)算機(jī)軟件開發(fā)及維護(hù),計(jì)算機(jī)信息系統(tǒng)集成服務(wù)等。的企業(yè)之一,為客戶提供良好的病毒測序,病毒全基因組測序,病毒宏基因組測序,未知病原鑒定。上海探普生物致力于把技術(shù)上的創(chuàng)新展現(xiàn)成對用戶產(chǎn)品上的貼心,為用戶帶來良好體驗(yàn)。上海探普生物始終關(guān)注醫(yī)藥健康市場,以敏銳的市場洞察力,實(shí)現(xiàn)與客戶的成長共贏。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/3107544.html
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