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產(chǎn)品關(guān)鍵詞:北京基因突變熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
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Ct(閾值循環(huán))是擴(kuò)增曲線與閾值線的交叉點(diǎn)(圖 1B),北京基因突變熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),北京基因突變熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)。它是 PCR 反應(yīng)中靶標(biāo)濃度的相對測量。除靶標(biāo)濃度之外,還有很多因素會影響 Ct 的***值。我們將要討論最常見的可能影響 Ct 值的非模板依賴性因素,并描述如何評估實(shí)時熒光定量 PCR 反應(yīng)的性能。
顯示實(shí)時反應(yīng)擴(kuò)增圖的幾個參數(shù)。圖 1B 中的**期對應(yīng)于圖 1C 中的線性期。閾值必須設(shè)在擴(kuò)增圖的線性期中。Ct 值隨模板量減少而增加。然而,北京基因突變熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),反應(yīng)混合物或儀器中的任何干擾,只要能影響與 Ct 計(jì)算相關(guān)的熒光測定,都會使 Ct 值產(chǎn)生非模板依賴性的變化。因此,在不同條件下或用不同試劑進(jìn)行的 PCR 反應(yīng)產(chǎn)生的 Ct 值不可以直接進(jìn)行比較。
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟:
取凍存已裂解的細(xì)胞,室溫放置5分鐘使其完全溶解。
兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
實(shí)時熒光定量PCR(Real-Time PCR)技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù),它是通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),然后利用熒光信號的積累強(qiáng)弱實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知的DNA模板進(jìn)行定量,實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,為快速準(zhǔn)確地分析樣本中的各類待檢物質(zhì)提供了嶄新的技術(shù)工具,現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及臨床**標(biāo)志物的檢測。Real-Time PCR與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比其使用了熒光探針標(biāo)記特定核酸從而提高了準(zhǔn)確性;靈敏度提高故使用較少的樣本量,從而減少了樣本消耗殆盡的風(fēng)險(xiǎn),在一小時左右即可出結(jié)果,簡化了傳統(tǒng)PCR方法;全封閉管分析、利用電腦分析軟件對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時動態(tài)的檢測和自動定量,定量動態(tài)范圍高達(dá)五個數(shù)量級,且結(jié)果重現(xiàn)性較好,這也提高了檢測的靈敏度和精密度。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/330933.html
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