Rn 值是由 Applied Biosystems? FAM? 染料的熒光除以 ROX 染料的熒光而計算得出的比率。因此，假定 FAM 染料產(chǎn)生的熒光信號保持不變，ROX 染料量越少，產(chǎn)生的 Rn 值就越高。這將導(dǎo)致 Rn 基線上升，以及隨后 ΔRn 的減少和 Ct 值的變化。通過降低 ROX 染料水平而得到不同 Ct 值，沒有對反應(yīng)的真實靈敏度產(chǎn)生任何影響，卻有著意想不到的后果，天津轉(zhuǎn)基因熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，天津轉(zhuǎn)基因熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，天津轉(zhuǎn)基因熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)。如圖 4 所示，降低 ROX 染料的濃度可能會增加 Ct 值的標準差。標準差越大，分辨靶濃度之間的細微區(qū)別的可信度就越低（參加下文的精確度一節(jié)）。

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熒光定量PCR實驗步驟：

  取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

  兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

  RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

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