Ct（閾值循環(huán)）是擴(kuò)增曲線與閾值線的交叉點(diǎn)（圖 1B）。它是 PCR 反應(yīng)中靶標(biāo)濃度的相對測量。除靶標(biāo)濃度之外，還有很多因素會影響 Ct 的***值。我們將要討論最常見的可能影響 Ct 值的非模板依賴性因素，并描述如何評估實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)的性能。

顯示實(shí)時(shí)反應(yīng)擴(kuò)增圖的幾個參數(shù)。圖 1B 中的**期對應(yīng)于圖 1C 中的線性期，上?；虮磉_(dá)熒光定量PCR分析服務(wù)。閾值必須設(shè)在擴(kuò)增圖的線性期中。Ct 值隨模板量減少而增加，上?；虮磉_(dá)熒光定量PCR分析服務(wù)。然而，反應(yīng)混合物或儀器中的任何干擾，只要能影響與 Ct 計(jì)算相關(guān)的熒光測定，上海基因表達(dá)熒光定量PCR分析服務(wù)，都會使 Ct 值產(chǎn)生非模板依賴性的變化。因此，在不同條件下或用不同試劑進(jìn)行的 PCR 反應(yīng)產(chǎn)生的 Ct 值不可以直接進(jìn)行比較。

比較Ct值的相對定量法：此方法是將待測靶基因片段和內(nèi)參照基因片段同時(shí)擴(kuò)增，可以在兩個反應(yīng)管中或者一個反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并且就兩者的ct值之差進(jìn)行測量。在采用此方法過程中需要用數(shù)學(xué)公式進(jìn)行相對量的計(jì)算，首先要假設(shè)每個循環(huán)產(chǎn)物增加一倍時(shí)PCR反應(yīng)**期得到Ct值對起始模板的量一個循環(huán)的估算和起始模板數(shù)兩倍相當(dāng)。這種方法的前提是靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致，所以在應(yīng)用過程中效率的偏移會對實(shí)際拷貝數(shù)估計(jì)產(chǎn)生一定影響，因此，為了保證目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相等應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對反應(yīng)體系的優(yōu)化，這也是該方法應(yīng)用的難點(diǎn)之一

在PCR擴(kuò)增時(shí)加入一對引物的同時(shí)加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標(biāo)記一個報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。

在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號**擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光閾值的設(shè)置是PCR反應(yīng)**-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

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