比較Ct值的相對(duì)定量法：此方法是將待測(cè)靶基因片段和內(nèi)參照基因片段同時(shí)擴(kuò)增，可以在兩個(gè)反應(yīng)管中或者一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，北京siRNA熒光定量PCR分析服務(wù)，并且就兩者的ct值之差進(jìn)行測(cè)量，北京siRNA熒光定量PCR分析服務(wù)。在采用此方法過(guò)程中需要用數(shù)學(xué)公式進(jìn)行相對(duì)量的計(jì)算，首先要假設(shè)每個(gè)循環(huán)產(chǎn)物增加一倍時(shí)PCR反應(yīng)**期得到Ct值對(duì)起始模板的量一個(gè)循環(huán)的估算和起始模板數(shù)兩倍相當(dāng)。這種方法的前提是靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致，北京siRNA熒光定量PCR分析服務(wù)，所以在應(yīng)用過(guò)程中效率的偏移會(huì)對(duì)實(shí)際拷貝數(shù)估計(jì)產(chǎn)生一定影響，因此，為了保證目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相等應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，這也是該方法應(yīng)用的難點(diǎn)之一

純度檢測(cè)

  RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

  變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定

  制膠

  1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

  灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。

  準(zhǔn)備RNA樣品

  取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

  電泳

  上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2–3cm。

  紫外透射光下觀察并拍照

無(wú)論 Ct ***值是多少，任何能夠有效擴(kuò)增和檢測(cè)起始模板拷貝數(shù)為 1 的系統(tǒng)都達(dá)到了靈敏度的極限。

如前文所述，效率是決定反應(yīng)靈敏度的關(guān)鍵因素（圖 5）。在檢測(cè)極低拷貝數(shù)時(shí)的另一個(gè)重要的考慮因素是，不能預(yù)期模板為正態(tài)分布。相反，它會(huì)遵循泊松分布，該分布預(yù)測(cè)在平均包含一個(gè)拷貝的起始模板的大量重復(fù)中，實(shí)際上約 37% 不含拷貝，*有約 37% 含有 1 個(gè)拷貝，18% 應(yīng)包含 2 個(gè)拷貝（見(jiàn)圖 9）。因此，為了可靠地檢測(cè)低拷貝，必須做大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)提供統(tǒng)計(jì)***性，以克服泊松分布的限制。

文章來(lái)源地址: http://www.cdcfah.com/cp/388483.html