懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，每5×106-1×107 個細(xì)胞加入1ml Trizol， 再用移液器反復(fù)吹打?！咀ⅰ考尤?Trizol 前應(yīng)避免洗滌細(xì)胞，會增加 mRNA 降解的可能性。

         c. 動、植物組織：取-80°C 凍存的組織在液氮中充分研磨后加入適量的Trizol混勻；或者取新鮮動物或植物組織盡量剪碎，然后加入適量的 Trizol 進行勻漿處理。

將勻漿樣品劇烈震蕩后在室溫條件下放置 5 分鐘以使**白體完全裂解?！咀ⅰ看瞬讲荒苁÷裕虾?分鐘完成RNA提取試劑盒***的選擇，時間可以長于 5 分鐘。

（可選步驟）4°C，12000rpm 離心 10 分鐘，取上清。【注】如果樣品中含有較多蛋白，上海9分鐘完成RNA提取試劑盒***的選擇、脂肪、多糖等可離心除去。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜、多糖、高分子量的 DNA 等物質(zhì)，上清中含有 RNA。處理脂肪組織樣品時，上海9分鐘完成RNA提取試劑盒***的選擇，上層是大量油脂， 應(yīng)除去，然后再取澄清的勻漿溶液進行下一步的操作。

 

RNA 常用提取方法（1）

1、異硫氰酸胍氯化銫超速離心法:

     原理：使用蛋白質(zhì)變性劑異硫氰酸胍有效制抑RN A 酶的活性，經(jīng)過起始密度為1.78g/m l 的氯化銫介質(zhì)，進行密度梯度超速離心，RNA沉淀于管底，而DNA與蛋白質(zhì)在上清中。使用這種方法，不但能得到高質(zhì)量的RNA ，而且能同時分離出細(xì)胞染色體DNA。

   

2、鹽酸胍-有機溶劑法：

     原理：本法有MacDonald1987年在Strohman報道的方法基礎(chǔ)上改進而成的，適用于沒有超速離心及設(shè)備的情況下提取細(xì)胞總RNA。它利用鹽酸胍制抑RNA酶，勻漿裂解細(xì)胞，有機溶劑抽提去除蛋白質(zhì),通過選擇性沉淀RNA分子而去除DNA。

     

3、氯化鋰-尿素法：

     原理：本法首先由Auffray報道,利用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時制抑RNA酶，3 mol/L LiCl選擇性沉淀RNA。 

      

RNA提取注意事項（5）

純化得到的RNA可能需要通過沉淀來濃縮，以滿足一些下游應(yīng)用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀（加0.1體積的5 M 醋酸銨、2-2.5體積的無水乙醇，-20°C放置25分鐘以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA ）的方法。核酸助沉劑是linear acrylamide，當(dāng)RNA用于RT-PCR分析時，線性的丙烯酰胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑，因為它們都不含DNA污染，糖原含量高會制抑PCR反應(yīng)。酵母RNA和未處理的糖原會給樣品帶來核酸污染，有可能影響RT-PCR的結(jié)果。沉淀后，注意避免RNA沉淀過分干燥，因為這可能導(dǎo)致很難重新溶解。

文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/420781.html