熒光信號**擴增階段：只有在熒光產(chǎn)生進入**期， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，所以在PCR反應(yīng)處于**期的某一點上來檢測PCR產(chǎn)物的量，由此來推斷模板**初的含量而進行定量分析。研究表明，天津siRNA熒光定量PCR課題承包，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，天津siRNA熒光定量PCR課題承包。通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可得到標準曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，天津siRNA熒光定量PCR課題承包，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)

在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈**級的增加，所以反應(yīng)終產(chǎn)物量與起始模板量之間已經(jīng)不存在線性關(guān)系，通過反應(yīng)終產(chǎn)物也算不出起始DNA拷貝數(shù) 天津siRNA熒光定量PCR課題承包

熒光定量PCR 實驗步驟（1） 

樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

②每樣品加入1ml的TRIZOL試劑裂解，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用移液器反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 天津基因表達熒光定量PCR分析服務(wù)

實時熒光定量常用Taqman探針法和SYBR Green I法兩類。

1.TaqMan探針法

TaqMan 探針法是具有高度特異性的定量PCR技術(shù)。它的工作原理為有一對 PCR 引物和一條探針存在于PCR 反應(yīng)體系中，有熒光淬滅基團存在于3′

端標記，有報告基團存在于探針的5′ 端標記，探針*和模板特異結(jié)合，兩條引物之間是其結(jié)合點。因此信號儀器搜集不到，伴隨反應(yīng)的進展，探針在外切核酸酶的活性的作用下被切斷，從而造成淬滅基團不能吸收基團的熒光能量，從而使熒光信號產(chǎn)生，所以模板 DNA 的拷貝數(shù)取決于信號的強度。

2.SYBR Green I法

SYBR Green I為一種具有綠色激發(fā)波長的染料，其發(fā)射波長比較大約為 520 nm，比較大吸收波長約為 497 nm，能夠結(jié)合所有的雙螺旋小溝區(qū)域。由于處于游離狀態(tài)，SYBR Green I發(fā)出的熒光較弱，然而其結(jié)合雙鏈 DNA之后，就會使得熒光**增強，熒光信號的增加完全同步PCR 產(chǎn)物的增加。

RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。

  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

  溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用***反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定

  先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

管家基因反應(yīng)體系： 序號 反應(yīng)物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl 3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待測樣品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

  制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應(yīng)條件為：93℃2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。 針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應(yīng)。

  反應(yīng)體系： 序號 反應(yīng)物 劑量 1 10×PCR緩沖液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至總體積為 25ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

  35個PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72℃延伸5分鐘。

  PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。

  將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。 所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應(yīng)體系。 北京病原微生物熒光定量PCR檢測服務(wù)

天津siRNA熒光定量PCR課題承包

TaqMan探針法：TaqMan 探針法是具有高度特異性的定量 PCR 技術(shù)。它的工作原理是在 PCR 反應(yīng)體系中存在一對 PCR 引物和一條探針，探針的5′ 端標記有報告基團，3′ 端標記有熒光淬滅基團，探針只與模板特異結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。當(dāng)探針完整的時候，報告基團的熒光能量被淬滅基團吸收，所以儀器搜集不到信號，隨著反應(yīng)的進展，Taq酶遇到探針，利用 3′→5′ 外切核酸酶的活性把探針切斷，導(dǎo)致報告基團的熒光能量不能被淬滅基團吸收，產(chǎn)生了熒光信號，因此信號的強度就**了模板 DNA 的拷貝數(shù)天津siRNA熒光定量PCR課題承包

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