pH)漂洗5min×3/次，不時震蕩(洗去多余游離的熒光素標記的抗體)?！ぞ彌_甘油封片–分析純無熒光的甘油9份+pH，天津多標記免疫組化實驗服務，。·鏡檢：在熒光顯微鏡下觀察?！?yōu)點：方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少，天津多標記免疫組化實驗服務?！と秉c：敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。若檢測多種抗原需制備多種相應的熒光標記抗體。?直接免疫熒光法的注意事項·對熒光標記的抗體的稀釋：要保證抗體的蛋白有一定的濃度；·一般稀釋度不應超過1:20，抗體濃度過低，天津多標記免疫組化實驗服務，會導致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結果的觀察。?直接免疫熒光法的注意事項(續(xù))·染色溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化；–染色時間：從10min到數(shù)小時，一般30min；–染色溫度：多采用室溫(25?C)，高于37?C可加強染色效果，但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎***)可采用0-2?C的低溫，延長染色時間。–低溫染色過夜較37?C30min效果好的多。?直接免疫熒光法的注意事項(續(xù))·試驗時需設置下列對照：–自發(fā)熒光對照(空白對照)：標本加，。–陽性對照：用已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。–特異性對照(***試驗)：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。天津多標記免疫組化實驗服務

    具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。***，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當?shù)碾x心。6）復染目的是形成細胞輪廓，從而更好對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。7）封片為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。8）切片清洗為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當?shù)丶訌娗逑矗ㄑ娱L時間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意：⑴單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。⑵溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；⑶沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。⑷PBS的PH和離子強度的使用和要求。天津四色免疫組化染色服務

    因而乙醇固定時間不宜過長(2h內)。·乙醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度。(3)其它固定劑·**：–對抗原性的保存好，但脫水性更強，較少用于組織標本，但細胞爬片常用**固定。3、抗原修復——原因·常規(guī)的石蠟切片標本均用甲醛固定，結果使得：–抗原性物質形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；–蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽?！ひ螅涸谌旧珪r，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復抗原的原有空間形態(tài)。3、抗原修復——方法·化學方法·加熱方法–水浴加熱法–微波照射法–高壓加熱法–酸水解法(1)化學方法·主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。–胰蛋白酶：一般使用濃度為～，消化時間為37?C，10～40**要用于細胞內抗原的顯示；–胃蛋白酶：一般使用濃度為～，消化時間為37?C、30～180**要用于細胞間質抗原的顯示。·例如：Laminin、CollagenIV(2)水浴加熱法·將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù)10～15分鐘。–優(yōu)點：操作簡單、經(jīng)濟，適用于所有的實驗室。

    這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議pH在。（中性及弱堿性條件（pH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）9）拍照有條件的話比較好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以**多不得超過2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。***中應避免數(shù)次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后；標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。

    是一種小分子維生素，分子量為244，是轉氨甲?；^程中的輔酶?！た股锼?avidin)，又稱卵白素或親和素，是一種分子量為67000的堿性蛋白，對生物素具有很強的親和力，比抗原抗體間的親和力要高出100萬倍。它由4個亞基組成，每個亞基都有生物素的結合位點?！烧呔膳c抗體等大分子生物活性物質相偶聯(lián)，又可被酶類等多種示蹤物所標記，形成生物素-抗生物素系統(tǒng)。–該系統(tǒng)一端偶聯(lián)大分子生物反應體系，另一端連結標記物，后者加入酶的底物，產(chǎn)生顏色反應。(1)標記抗生物素—生物素法(labelledavidin-biotinmethod,LAB)：分為直接法和間接法。·直接法用生物素標記***抗體，與抗原結合；酶標記抗生物素，與生物素結合，然后進行酶呈色反應?！らg接法用生物素標記二抗，酶標記抗生物素，先用***抗體與組織抗原結合，再將第二抗體與***抗體相連結，***進行呈色反應。(2)橋抗生物素一生物素法(bridgeavidin-biotinmethod，BRAB)–此法是用生物素分別標記抗體和酶，以抗生物素為橋，把二者連接起來，進行呈色反應。(3)抗生物素-生物素-過氧化物酶法(ABC法)·ABC法是在BRAB和LAB的基礎上改良的方法?！BC復合物是將過氧化物酶結合在生物素上。上海多靶點免疫組化技術服務

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    –缺點：對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。(3)微波照射法·將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，置微波爐加熱至95℃以上，持續(xù)l0～15分鐘，冷卻后，按免疫組化染色步驟進行?！ご朔椒ㄓ捎谖⒉▓鰞葮O性分子、離子高速運動，撞擊交聯(lián)的網(wǎng)鏈，使抗原異常的構想恢復正常，且因分子運動產(chǎn)熱、效率高、時間短，對抗原再現(xiàn)效果好。(4)高壓加熱法暴露抗原·將玻片浸入抗原修復液內，置高壓鍋中高壓2～3min，可取得極好的效果?！び捎诟邏合率軣峋鶆?，特別使用于大批量標本的染色。(1)酸水解法·酸水解可使交聯(lián)斷裂、暴露抗原?！⒉Ｆ?mol/LHCl溶液中，室溫作用20min(溫度升高，作用時間縮短)?！ご朔茉鰪娞禺愋匀旧?，降低背景，但需注意水解過度將破壞抗原性及形態(tài)結構。加熱法的注意事項·達到規(guī)定的溫度(92～95?C以上)；·維持一定的時間；·避免切片干涸(抗原可能完全丟失)；·加熱后必須經(jīng)過室溫自然冷卻20～30分鐘，使未折疊的蛋白分子鏈恢復天然構型；·修復液：–**常用的是；–***研究表明堿性修復液更有效，推薦使用1mM的EDTA緩沖液()。4、載玻片的處理·抗原修復過程中，由于高溫、高壓等諸多固素的影響，極易造成脫片。為防預防脫發(fā)片，常用粘附劑處理載玻片。天津多標記免疫組化實驗服務

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