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產(chǎn)品關鍵詞:上海膜蛋白Western Blot實驗外包,western blot
***更新:2020-07-05 07:21:49
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詳細說明
全自動單細胞western blot檢測分析原理:全自動單細胞western blot分析是單細胞水平,蛋白質(zhì)表達定量分析系統(tǒng),上海膜蛋白Western Blot實驗外包。系統(tǒng)采用**的微流控western blot芯片,通過單細胞微孔設計,采集單細胞,然后原位裂解細胞,釋放蛋白,上海膜蛋白Western Blot實驗外包,進行蛋白質(zhì)電泳,上海膜蛋白Western Blot實驗外包,將不同分子量蛋白進行分離,提高免疫學檢測特異性。之后,采用**技術(shù)進行蛋白質(zhì)原位捕獲,使用western blot驗證抗體及熒光標記二抗直接雜交,掃描儀進行芯片掃描后,分析軟件對掃描結(jié)果進行深度定量分析。上海膜蛋白Western Blot實驗外包
Western blotting堪稱蛋白質(zhì)研究中的經(jīng)典方法。學生物的幾乎無人不曉,即使沒親手做過,也清楚其原理。經(jīng)典果然是經(jīng)典,30年來其操作步驟幾乎沒變過,依然是跑膠-轉(zhuǎn)膜-封閉-孵育-檢測。近兩年,各大公司陸續(xù)推出了Western blotting方面的新儀器,如新型轉(zhuǎn)印系統(tǒng),確實能省時省力不少,但仍然不能完全克服研究人員在面臨的挑戰(zhàn)。Western
blotting仍存在重復性差、實驗耗時長、無法準確定量等問題。
近日,美國proteinsimple公司推出了一種Simple Western?分析,徹底改變了整個Western blot。此分析在一臺名為Simon的儀器上開展,Simon將所有實驗步驟自動化,包括蛋白上樣和分離、免疫印跡、洗滌、檢測以及數(shù)據(jù)的定量分析,讓研究人員從繁重的勞動中解放出來,同時避免了可能影響實驗重復性的人為因素。 上海微量蛋白Western Blot免疫印跡服務
收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
可以使用適當?shù)牧呀庖?,Western及IP細胞裂解液、RIPA裂解液等,裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白,例如細胞**白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等,可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白,也可以使用試劑盒進行抽提。收集完蛋白樣品后,為確保每個蛋白樣品的上樣量一致,需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同,需要采用適當?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用Western及IP細胞裂解液或RIPA裂解液,可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒
轉(zhuǎn)膜(Transfer)
推薦在Western實驗中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用,但硝酸纖維素膜比較脆,在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。
通常如果使用Bio-Rad的標準濕式轉(zhuǎn)膜裝置,可以設定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA,轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉(zhuǎn)膜時間越長,目的蛋白的分子量越小,需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。在轉(zhuǎn)膜過程中,特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時,通常會有非常嚴重的發(fā)熱現(xiàn)象,比較好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進行轉(zhuǎn)膜。
轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質(zhì)分子量標準,通常分子量比較大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進行染色,以觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液(P0017)對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進行染色,以觀察蛋白的殘留情況。
全自動western blot無需凝膠、無需轉(zhuǎn)印,放入您的樣品,按個按鈕,然后就沒事了。首先,將樣品與Simple
Western樣品緩沖液混合,至終濃度1 μg/μL,還原并變性,然后將制備好的樣品、一抗和二抗、化學發(fā)光底物分配到384孔分析板的指定孔中。之后,將Simple
Western分析緩沖液、毛細管和制備好的分析板放入Simon內(nèi),它自動開展所有分析步驟。當?shù)鞍籽刂毠軆?nèi)一個堆積和分離基質(zhì)遷移時,它們分離。分離后的蛋白固定到毛細管壁上。之后利用一抗鑒定目標蛋白,用HRP結(jié)合的二抗和化學發(fā)光底物檢測蛋白。系統(tǒng)自動報告檢測蛋白的分子量和信號。每次實驗可同時分析**多12個樣品,結(jié)果可在3-5小時內(nèi)獲得。15-150 kDa的目標蛋白均可檢測。軟件報告每個檢測蛋白的分子量、面積、面積百分比和信噪比。對于傳統(tǒng)的Western blot而言,結(jié)果的重復性一直是個挑戰(zhàn),因為缺乏標準化的操作,且多個操作步驟引入了實驗可變性。而Simple Western分析是完全自動化的,因此結(jié)果的重復性更好。整體的定量也**改善了,因為省去了轉(zhuǎn)印步驟,從而避免了蛋白轉(zhuǎn)移的不一致。 江蘇熒光Western Blot實驗外包
上海膜蛋白Western Blot實驗外包
轉(zhuǎn)膜完畢后,立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液(P0023C)中,漂洗1-2分鐘,以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟,一定要注意膜的保濕,避免膜的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。用微型臺式真空泵或滴管等吸盡封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳,可以4℃緩慢搖動孵育過夜。或更據(jù)抗體的說明選擇適當?shù)姆跤郎囟群蜁r間。微型臺式真空泵或滴管等吸盡洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。 回收二抗。加入Western洗滌液,在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。使用
ECL化學發(fā)光試劑來檢測蛋白。壓片可以采用**的壓片暗盒進行。洗片時可以使用X光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機,可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進行手工洗片。X光片推薦選用柯達原裝的生物實驗**柯達X-OMAT BT膠片。 上海膜蛋白Western Blot實驗外包
上海朝瑞生物科技有限公司坐落上海市松江區(qū)廣富林路697號昂立大廈2113室,交通便利,環(huán)境優(yōu)美,是一家服務型企業(yè)。上海朝瑞科技是一家有限責任公司企業(yè),一直貫徹“以人為本,服務于社會”的經(jīng)營理念;“質(zhì)量高速,誠守信譽,持續(xù)發(fā)展”的質(zhì)量方針。公司始終堅持客戶需求***的原則,致力于提供高質(zhì)量的[ "科研技術(shù)服務", "應用技術(shù)服務", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學產(chǎn)品銷售" ]。上海朝瑞科技自成立以來,一直堅持走正規(guī)化、專業(yè)化路線,得到了廣大客戶及社會各界的普遍認可與大力支持。
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