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產(chǎn)品關鍵詞:上海磷酸化蛋白Western Blot檢測分析服務,western blot
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詳細說明
1.為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)??乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶陰電荷,在聚丙烯酰膪凝膠中從陰極向陽極泳動,分子量越小,泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶)。2.電轉移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上,選用低電壓(100V)和大電流(1~2A),通電45min轉移即可完成。此階段分離的蛋白質條帶肉眼仍不可見。3.酶免疫定位。將印有蛋白質條帶的硝酸纖維素膜(相當于包被了抗原的固相載體)依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后,加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物,使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3,3,—二氨基聯(lián)苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈藍紫色)。陽性反應的條帶清晰可辨,并可根據(jù)SDS-PAGE時加人的分子量標準,確定各組分的分子量,上海磷酸化蛋白Western Blot檢測分析服務。本法綜合了SDS-PAGE的辨力和ELISA法的高特異性和敏感性,上海磷酸化蛋白Western Blot檢測分析服務,是一個有效的分析手段,不僅廣泛應用于分析抗原組分及其免疫活性,上海磷酸化蛋白Western Blot檢測分析服務,并可用于疾病的診斷。在**中此法作為確診試驗??乖?jīng)電泳轉移在硝酸纖維素膜上后,將膜切成小條,配合酶標抗體及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實驗室中供檢測用。 上海磷酸化蛋白Western Blot檢測分析服務
免疫印跡法(immunoblotting )因與Southern早先建立的檢測核酸的印跡方法Southern
blot相類似,亦被稱為Western blot。免疫印跡(western blotting)是在蛋白質電泳分離和抗原抗體檢測的基礎上發(fā)展起來一項檢測蛋白質的技術。它將SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的辨力與抗原抗體反應的特異性相結合。典型的印跡實驗包括三個步驟①蛋白質的電泳分離;②將電泳后凝膠上的蛋白質轉移至固體膜上,用非特異性,非反應活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質區(qū)域;③免疫學檢測。免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進行免疫學分析的弊端,極大地提高了其利用率、分辨率和靈敏度,使其成為使用**的免疫化學方法之一。 北京磷酸化蛋白Western Blot檢測服務
轉膜(Transfer)
推薦在Western實驗中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用,但硝酸纖維素膜比較脆,在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。
通常如果使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置,可以設定轉膜電流為300-400mA,轉膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉膜過夜。具體的轉膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉膜時間越長,目的蛋白的分子量越小,需要的轉膜時間越短。在轉膜過程中,特別是高電流快速轉膜時,通常會有非常嚴重的發(fā)熱現(xiàn)象,比較好把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。
轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準,通常分子量比較大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進行染色,以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液(P0017)對完成轉膜的SDS-PAGE膠進行染色,以觀察蛋白的殘留情況。
收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
可以使用適當?shù)牧呀庖?,Western及IP細胞裂解液、RIPA裂解液等,裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白,例如細胞**白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等,可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白,也可以使用試劑盒進行抽提。收集完蛋白樣品后,為確保每個蛋白樣品的上樣量一致,需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同,需要采用適當?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用Western及IP細胞裂解液或RIPA裂解液,可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以使用商業(yè)生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。
(2) 樣品處理:在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關文獻資料配制100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白。
(3) 上樣與電泳:冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。 為了便于觀察電泳效果和轉膜效果,以及判斷蛋白分子量大小,比較好使用預染蛋白質分子量標準(P0066)。電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳,而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置或類似電泳裝置,低電壓可以設置在80-100V,高電壓可以設置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳,或者可以根據(jù)預染蛋白質分子量標準的電泳情況,預計目的蛋白已經(jīng)被適當分離后即可停止電泳。 天津長條帶Western Blot實驗外包
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全自動單細胞western blot檢測分析原理:全自動單細胞western blot分析是單細胞水平,蛋白質表達定量分析系統(tǒng)。系統(tǒng)采用**的微流控western blot芯片,通過單細胞微孔設計,采集單細胞,然后原位裂解細胞,釋放蛋白,進行蛋白質電泳,將不同分子量蛋白進行分離,提高免疫學檢測特異性。之后,采用**技術進行蛋白質原位捕獲,使用western blot驗證抗體及熒光標記二抗直接雜交,掃描儀進行芯片掃描后,分析軟件對掃描結果進行深度定量分析。上海磷酸化蛋白Western Blot檢測分析服務
上海朝瑞生物科技有限公司成立于2003-01-22,專業(yè)1.發(fā)布科研技術 2.發(fā)布應用技術 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務 9.發(fā)布實驗室及儀器設備共享 10.發(fā)布培訓基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務 15.發(fā)布資源交換業(yè)務等多項業(yè)務,主營業(yè)務涵蓋[ "科研技術服務", "應用技術服務", "科研成果轉化", "科學產(chǎn)品銷售" ]。公司目前擁有高技術人才5~10人人,以不斷增強企業(yè)核心競爭力,加快企業(yè)技術創(chuàng)新,實現(xiàn)穩(wěn)健生產(chǎn)經(jīng)營。上海朝瑞生物科技有限公司主營業(yè)務涵蓋[ "科研技術服務", "應用技術服務", "科研成果轉化", "科學產(chǎn)品銷售" ],堅持“質量***、質量服務、顧客滿意”的質量方針,贏得廣大客戶的支持和信賴。一直以來公司堅持以客戶為中心、[ "科研技術服務", "應用技術服務", "科研成果轉化", "科學產(chǎn)品銷售" ]市場為導向,重信譽,保質量,想客戶之所想,急用戶之所急,全力以赴滿足客戶的一切需要。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/558071.html
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