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產(chǎn)品關(guān)鍵詞:天津微量蛋白Western Blot檢測服務(wù),western blot
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詳細(xì)說明
收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?,Western及IP細(xì)胞裂解液,天津微量蛋白Western Blot檢測服務(wù)、RIPA裂解液等,裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白,天津微量蛋白Western Blot檢測服務(wù),例如細(xì)胞**白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等,可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白,也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。收集完蛋白樣品后,天津微量蛋白Western Blot檢測服務(wù),為確保每個蛋白樣品的上樣量一致,需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同,需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用Western及IP細(xì)胞裂解液或RIPA裂解液,可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒 天津微量蛋白Western Blot檢測服務(wù)
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以使用商業(yè)生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。
(2) 樣品處理:在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白。
(3) 上樣與電泳:冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。 為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,以及判斷蛋白分子量大小,比較好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(P0066)。電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳,而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置,低電壓可以設(shè)置在80-100V,高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。通常電泳時溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳,或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況,預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。 北京線粒體蛋白Western Blot檢測服務(wù)
轉(zhuǎn)膜(Transfer)
推薦在Western實驗中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用,但硝酸纖維素膜比較脆,在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。
通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置,可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA,轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉(zhuǎn)膜時間越長,目的蛋白的分子量越小,需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。在轉(zhuǎn)膜過程中,特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時,通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象,比較好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),通常分子量比較大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進(jìn)行染色,以觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液(P0017)對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色,以觀察蛋白的殘留情況。
全自動western blot無需凝膠、無需轉(zhuǎn)印,放入您的樣品,按個按鈕,然后就沒事了。首先,將樣品與Simple
Western樣品緩沖液混合,至終濃度1 μg/μL,還原并變性,然后將制備好的樣品、一抗和二抗、化學(xué)發(fā)光底物分配到384孔分析板的指定孔中。之后,將Simple
Western分析緩沖液、毛細(xì)管和制備好的分析板放入Simon內(nèi),它自動開展所有分析步驟。當(dāng)?shù)鞍籽刂?xì)管內(nèi)一個堆積和分離基質(zhì)遷移時,它們分離。分離后的蛋白固定到毛細(xì)管壁上。之后利用一抗鑒定目標(biāo)蛋白,用HRP結(jié)合的二抗和化學(xué)發(fā)光底物檢測蛋白。系統(tǒng)自動報告檢測蛋白的分子量和信號。每次實驗可同時分析**多12個樣品,結(jié)果可在3-5小時內(nèi)獲得。15-150 kDa的目標(biāo)蛋白均可檢測。軟件報告每個檢測蛋白的分子量、面積、面積百分比和信噪比。對于傳統(tǒng)的Western blot而言,結(jié)果的重復(fù)性一直是個挑戰(zhàn),因為缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的操作,且多個操作步驟引入了實驗可變性。而Simple Western分析是完全自動化的,因此結(jié)果的重復(fù)性更好。整體的定量也**改善了,因為省去了轉(zhuǎn)印步驟,從而避免了蛋白轉(zhuǎn)移的不一致。
1.為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷,在聚丙烯酰膪凝膠中從陰極向陽極泳動,分子量越小,泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶)。2.電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,選用低電壓(100V)和大電流(1~2A),通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。3.酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜(相當(dāng)于包被了抗原的固相載體)依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后,加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物,使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3,3,—二氨基聯(lián)苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈藍(lán)紫色)。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨,并可根據(jù)SDS-PAGE時加人的分子量標(biāo)準(zhǔn),確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的辨力和ELISA法的高特異性和敏感性,是一個有效的分析手段,不僅廣泛應(yīng)用于分析抗原組分及其免疫活性,并可用于疾病的診斷。在**中此法作為確診試驗。抗原經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上后,將膜切成小條,配合酶標(biāo)抗體及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實驗室中供檢測用。 上海全自動Western Blot技術(shù)服務(wù)
天津微量蛋白Western Blot檢測服務(wù)
近年來銷售競爭能力大幅度提高,成為全球精細(xì)化工產(chǎn)業(yè)相當(dāng)有活力、發(fā)展**快的市場。據(jù)統(tǒng)計,21世紀(jì)初期,歐美等發(fā)達(dá)國家的精細(xì)化工率已達(dá)到70%左右。進(jìn)入新的[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]萌芽期。我們所說的**化,是企業(yè)優(yōu)化產(chǎn)品結(jié)構(gòu),進(jìn)入高附加值的產(chǎn)品領(lǐng)域。從行業(yè)生命周期來看,一旦企業(yè)發(fā)展到成熟或者衰退階段,企業(yè)的生存環(huán)境就會變差,而行業(yè)處于萌芽或者成長階段,企業(yè)的生存環(huán)境相對較好。服務(wù)型中支出排名世界前列,研發(fā)模式也在發(fā)生改變:從以往由**主導(dǎo)轉(zhuǎn)向由企業(yè)個體驅(qū)動、與**研究機構(gòu)和大學(xué)相互協(xié)作的良性生態(tài)系統(tǒng),研發(fā)模式更加以市場為導(dǎo)向,更強調(diào)效率和回報。同時,知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)制度也得到加強。盡管在該領(lǐng)域仍有很長的路要走,但是不可否認(rèn)從制度到觀念已經(jīng)取得了不小的進(jìn)步。第三方物流的產(chǎn)生是社會專業(yè)化分工的體現(xiàn),化工企業(yè)通過將非**業(yè)務(wù)外包給專業(yè)公司,可以更傾向于將有限的資源集中發(fā)展**業(yè)務(wù)。因此,化工物流行業(yè)的發(fā)展前景廣闊。天津微量蛋白Western Blot檢測服務(wù)
上海朝瑞生物科技有限公司注冊資金700-1000萬元,是一家擁有5~10人***員工的企業(yè)。公司自成立以來,以質(zhì)量為發(fā)展,讓匠心彌散在每個細(xì)節(jié),公司旗下[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]深受客戶的喜愛。公司注重以質(zhì)量為中心,以服務(wù)為理念,秉持誠信為本的理念,打造化工質(zhì)量品牌。公司憑借深厚技術(shù)支持,年營業(yè)額度達(dá)到2000-3000萬元,并與多家行業(yè)**公司建立了緊密的合作關(guān)系。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/773958.html
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