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產(chǎn)品關(guān)鍵詞:天津常規(guī)蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)外包,western blot
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詳細(xì)說明
轉(zhuǎn)膜完畢后,立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液(P0023C)中,漂洗1-2分鐘,以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟,一定要注意膜的保濕,避免膜的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。用微型臺式真空泵或滴管等吸盡封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳,可以4℃緩慢搖動孵育過夜。或更據(jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間。微型臺式真空泵或滴管等吸盡洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時(shí)。 回收二抗。加入Western洗滌液,在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。使用
ECL化學(xué)發(fā)光試劑來檢測蛋白,天津常規(guī)蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)外包。壓片可以采用**的壓片暗盒進(jìn)行。洗片時(shí)可以使用X光片自動洗片機(jī),天津常規(guī)蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)外包。如果沒有自動洗片機(jī),天津常規(guī)蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)外包,可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。X光片推薦選用柯達(dá)原裝的生物實(shí)驗(yàn)**柯達(dá)X-OMAT BT膠片。 天津常規(guī)蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)外包
全自動單細(xì)胞western blot檢測分析原理:全自動單細(xì)胞western blot分析是單細(xì)胞水平,蛋白質(zhì)表達(dá)定量分析系統(tǒng)。系統(tǒng)采用**的微流控western blot芯片,通過單細(xì)胞微孔設(shè)計(jì),采集單細(xì)胞,然后原位裂解細(xì)胞,釋放蛋白,進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳,將不同分子量蛋白進(jìn)行分離,提高免疫學(xué)檢測特異性。之后,采用**技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)原位捕獲,使用western blot驗(yàn)證抗體及熒光標(biāo)記二抗直接雜交,掃描儀進(jìn)行芯片掃描后,分析軟件對掃描結(jié)果進(jìn)行深度定量分析。天津微量蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)外包
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以使用商業(yè)生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。
(2) 樣品處理:在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白。
(3) 上樣與電泳:冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。 為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,以及判斷蛋白分子量大小,比較好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(P0066)。電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳,而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置,低電壓可以設(shè)置在80-100V,高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳,或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況,預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。
轉(zhuǎn)膜(Transfer)
推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用,但硝酸纖維素膜比較脆,在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。
通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置,可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長,目的蛋白的分子量越小,需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。在轉(zhuǎn)膜過程中,特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí),通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象,比較好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),通常分子量比較大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進(jìn)行染色,以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液(P0017)對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色,以觀察蛋白的殘留情況。
1.為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)??乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶陰電荷,在聚丙烯酰膪凝膠中從陰極向陽極泳動,分子量越小,泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶)。2.電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,選用低電壓(100V)和大電流(1~2A),通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。3.酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜(相當(dāng)于包被了抗原的固相載體)依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后,加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物,使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3,3,—二氨基聯(lián)苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈藍(lán)紫色)。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨,并可根據(jù)SDS-PAGE時(shí)加人的分子量標(biāo)準(zhǔn),確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的辨力和ELISA法的高特異性和敏感性,是一個(gè)有效的分析手段,不僅廣泛應(yīng)用于分析抗原組分及其免疫活性,并可用于疾病的診斷。在**中此法作為確診試驗(yàn)??乖?jīng)電泳轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上后,將膜切成小條,配合酶標(biāo)抗體及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實(shí)驗(yàn)室中供檢測用。 江蘇全自動Western Blot技術(shù)服務(wù)
天津常規(guī)蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)外包
收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?,Western及IP細(xì)胞裂解液、RIPA裂解液等,裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白,例如細(xì)胞**白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等,可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白,也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。收集完蛋白樣品后,為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致,需要測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同,需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用Western及IP細(xì)胞裂解液或RIPA裂解液,可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒 天津常規(guī)蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)外包
上海朝瑞生物科技有限公司致力于化工,以科技創(chuàng)新實(shí)現(xiàn)***管理的追求。上海朝瑞科技深耕行業(yè)多年,始終以客戶的需求為向?qū)?,為客戶提?**的[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]。公司堅(jiān)持以技術(shù)創(chuàng)新為發(fā)展引擎,以客戶滿意為動力,目前擁有5~10人專業(yè)人員,年?duì)I業(yè)額達(dá)到2000-3000萬元。上海朝瑞科技始終關(guān)注化工行業(yè)。海納百川,有容乃大,國內(nèi)外同行的智慧都是促使我們前行的力量。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/775970.html
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