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產(chǎn)品關(guān)鍵詞:北京熒光Western Blot免疫印跡服務(wù),western blot
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1.為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)??乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶陰電荷,在聚丙烯酰膪凝膠中從陰極向陽(yáng)極泳動(dòng),分子量越小,泳動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(jiàn)(只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶)。2.電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,選用低電壓(100V)和大電流(1~2A),通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見(jiàn)。3.酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜(相當(dāng)于包被了抗原的固相載體)依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后,加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物,使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3,3,—二氨基聯(lián)苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈藍(lán)紫色),北京熒光Western Blot免疫印跡服務(wù)。陽(yáng)性反應(yīng)的條帶清晰可辨,并可根據(jù)SDS-PAGE時(shí)加人的分子量標(biāo)準(zhǔn),確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的辨力和ELISA法的高特異性和敏感性,北京熒光Western Blot免疫印跡服務(wù),是一個(gè)有效的分析手段,不僅廣泛應(yīng)用于分析抗原組分及其免疫活性,并可用于疾病的診斷,北京熒光Western Blot免疫印跡服務(wù)。在**中此法作為確診試驗(yàn)??乖?jīng)電泳轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上后,將膜切成小條,配合酶標(biāo)抗體及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實(shí)驗(yàn)室中供檢測(cè)用。 北京熒光Western Blot免疫印跡服務(wù)
Western blotting堪稱蛋白質(zhì)研究中的經(jīng)典方法。學(xué)生物的幾乎無(wú)人不曉,即使沒(méi)親手做過(guò),也清楚其原理。經(jīng)典果然是經(jīng)典,30年來(lái)其操作步驟幾乎沒(méi)變過(guò),依然是跑膠-轉(zhuǎn)膜-封閉-孵育-檢測(cè)。近兩年,各大公司陸續(xù)推出了Western blotting方面的新儀器,如新型轉(zhuǎn)印系統(tǒng),確實(shí)能省時(shí)省力不少,但仍然不能完全克服研究人員在面臨的挑戰(zhàn)。Western
blotting仍存在重復(fù)性差、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、無(wú)法準(zhǔn)確定量等問(wèn)題。
近日,美國(guó)proteinsimple公司推出了一種Simple Western?分析,徹底改變了整個(gè)Western blot。此分析在一臺(tái)名為Simon的儀器上開(kāi)展,Simon將所有實(shí)驗(yàn)步驟自動(dòng)化,包括蛋白上樣和分離、免疫印跡、洗滌、檢測(cè)以及數(shù)據(jù)的定量分析,讓研究人員從繁重的勞動(dòng)中解放出來(lái),同時(shí)避免了可能影響實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的人為因素。 北京熒光Western Blot免疫印跡服務(wù)
轉(zhuǎn)膜完畢后,立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液(P0023C)中,漂洗1-2分鐘,以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟,一定要注意膜的保濕,避免膜的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。用微型臺(tái)式真空泵或滴管等吸盡封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳,可以4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜?;蚋鼡?jù)抗體的說(shuō)明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間。微型臺(tái)式真空泵或滴管等吸盡洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。 回收二抗。加入Western洗滌液,在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。使用
ECL化學(xué)發(fā)光試劑來(lái)檢測(cè)蛋白。壓片可以采用**的壓片暗盒進(jìn)行。洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒(méi)有自動(dòng)洗片機(jī),可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。X光片推薦選用柯達(dá)原裝的生物實(shí)驗(yàn)**柯達(dá)X-OMAT BT膠片。
免疫印跡法(immunoblotting )因與Southern早先建立的檢測(cè)核酸的印跡方法Southern
blot相類似,亦被稱為Western blot。免疫印跡(western blotting)是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原抗體檢測(cè)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)一項(xiàng)檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)。它將SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的辨力與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合。典型的印跡實(shí)驗(yàn)包括三個(gè)步驟①蛋白質(zhì)的電泳分離;②將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固體膜上,用非特異性,非反應(yīng)活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域;③免疫學(xué)檢測(cè)。免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進(jìn)行免疫學(xué)分析的弊端,極大地提高了其利用率、分辨率和靈敏度,使其成為使用**的免疫化學(xué)方法之一。
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以使用商業(yè)生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。
(2) 樣品處理:在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白。
(3) 上樣與電泳:冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。 為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,以及判斷蛋白分子量大小,比較好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(P0066)。電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳,而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置,低電壓可以設(shè)置在80-100V,高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳,或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況,預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。 江蘇膜蛋白Western Blot檢測(cè)服務(wù)
北京熒光Western Blot免疫印跡服務(wù)
收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?,Western及IP細(xì)胞裂解液、RIPA裂解液等,裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白,例如細(xì)胞**白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等,可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白,也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。收集完蛋白樣品后,為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致,需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同,需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用Western及IP細(xì)胞裂解液或RIPA裂解液,可以使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 北京熒光Western Blot免疫印跡服務(wù)
上海朝瑞生物科技有限公司是一家1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長(zhǎng) 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗(yàn)檢測(cè)服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級(jí)改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實(shí)驗(yàn)室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項(xiàng)目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù)的公司,創(chuàng)建于2003-01-22。上海朝瑞科技深耕行業(yè)多年,始終以客戶的需求為向?qū)?,為客戶提?**的[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]。公司終堅(jiān)持自主研發(fā)創(chuàng)新發(fā)展理念,不斷優(yōu)化的技術(shù)、產(chǎn)品為客戶帶來(lái)效益,目前年?duì)I業(yè)額達(dá)到2000-3000萬(wàn)元。上海朝瑞科技創(chuàng)始人仲緒軍,始終關(guān)注客戶,以優(yōu)化創(chuàng)新的科技,竭誠(chéng)為客戶提供比較好的服務(wù)。
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