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產品關鍵詞:江蘇多標記免疫組化染色服務,免疫組化
***更新:2020-08-05 02:24:28
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6、看來主要禍根是抗體稀釋液的pH值出問題了,于是我又用PBS替代抗體稀釋液和新試劑盒內的試劑對組織切片做了免疫組化,結果還是沒有做出來:背景很深。這真把我搞慘了。難道還有什么原因嗎?通過仔細分析:一抗一定是結合上去了(老SP試劑盒結果很好),問題是二抗沒有結合上去也不對(因為***背景很深,這說明二抗可能也結合上去了),DAB孵育時間現在只用1,江蘇多標記免疫組化染色服務、5min也是背景深而特異性染色淺,那我又懷疑封閉血清了。7、我做了兩張切片:一張用老試劑盒內還剩下一點的血清而另一張用新試劑盒內的封閉血清,其余試劑(二抗、SP)均用新試劑盒提供的,結果是前一張效果很好,而后一張能夠看到特異性染色,但背景太深,拍照效果不佳??磥矸忾]血清也是罪會禍首之一。結果分析顯示:抗體稀釋液的PH值偏低和封閉血清的失效導致了我的免疫組化結果的不佳,望大家在以后的組化實驗中也要注意這兩個不太引人注意的關鍵問題。慘痛的教訓,值得引以為鑒。案例二DAB染色后切片著色呈陰性結果背景:其實免疫組化在DAB染色后一般有四種情況:陽性染色效果很好、陰性染色,江蘇多標記免疫組化染色服務,江蘇多標記免疫組化染色服務、非特異性染色很深、陰陽臉(染色不均勻)。而陰性染色是許多初學者經常遇到的頭疼問題。江蘇多標記免疫組化染色服務
收藏查看我的收藏0有用+1已投票0免疫組化編輯鎖定討論免疫組化,是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應,即抗原與抗體特異性結合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質),對其進行定位、定性及相對定量的研究,稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。中文名免疫組化外文名immunocytochemistry應用免疫學基本原理稱為免疫組織化學技術目錄1基本原理2分類3作用?標本?抗體?常用染色方法4操作步驟?操作步驟?化染色步驟5判定分析6意義?免疫組化鏡檢?細胞凋亡檢測?關于掉片7經驗總結?實驗為例?免疫個人感悟免疫組化基本原理編輯抗體和抗原之間的結合具有高度的特異性,免疫組織化學正是利用了這一原理。先將組織或細胞中的某種化學物質提取出來,以此作為抗原或半抗原,通過免疫動物后獲得特異性的抗體,再以此抗體去探測組織或細胞中的同類的抗原物質。由于抗原與抗體的復合物是無色的,因此還必須借助于組織化學的方法將抗原抗體結合的部位顯示出來,以其達到對組織或細胞中的未知抗原進行定性,定位或定量的研究。天津六色免疫組化分析服務
因而乙醇固定時間不宜過長(2h內)?!ひ掖际沟鞍鬃冃缘淖饔幂p,固定后可再溶解;染色過程中,溫育時間長,抗原可流失而減弱反應強度。(3)其它固定劑·**:–對抗原性的保存好,但脫水性更強,較少用于組織標本,但細胞爬片常用**固定。3、抗原修復——原因·常規(guī)的石蠟切片標本均用甲醛固定,結果使得:–抗原性物質形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇;–蛋白之間發(fā)生交聯而使抗原決定簇隱蔽。·要求:在染色時,需要先進行抗原修復或暴露,即將固定時分子之間所形成的交聯破壞,而恢復抗原的原有空間形態(tài)。3、抗原修復——方法·化學方法·加熱方法–水浴加熱法–微波照射法–高壓加熱法–酸水解法(1)化學方法·主要是通過一些酶的作用,使抗原決定簇暴露。常用的酶有:胰蛋白酶、胃蛋白酶等。–胰蛋白酶:一般使用濃度為~,消化時間為37?C,10~40**要用于細胞內抗原的顯示;–胃蛋白酶:一般使用濃度為~,消化時間為37?C、30~180**要用于細胞間質抗原的顯示?!だ纾篖aminin、CollagenIV(2)水浴加熱法·將玻片放入裝有抗原修復液的容器中,加熱至沸騰,持續(xù)10~15分鐘。–優(yōu)點:操作簡單、經濟,適用于所有的實驗室。
提高抗原檢測率。常用的修復方法從強到弱一般分為三種,高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種(具體的可以查閱相關資料,大量的:中性的、高pH的等)。我們實驗室一般用微波修復中火6min*4次,效果不錯。注意微波修復后自然冷卻30min左右(只要你覺得修復液的溫度達室溫即可)。5)細胞通透目的是使抗體能夠充分地進入胞內進行結合反應。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內,故在細胞免疫組化時尤為推薦使用,這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。在免疫組織化學(>10um厚切片)和免疫細胞化學中一般用TritonX-100作為細胞通透劑,在膜上打孔。同時也是一種去污劑,一般在PBS中加入后終濃度是,而前者終濃度是。石蠟切片4um左右可以不通透,因為細胞已經被切開了。6)滅活內源性過氧化物酶和生物素在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中,免疫組化反應結果容易收到內源性過氧化物酶和生物素的干擾,必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活。滅活內源性POD一般3%過氧化氫滅活時間短點,可以10min左右,而,一般10~30min。
3、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC):該熒光素能與細胞內蛋白質結合,比FITC穩(wěn)定性好,在生理條件下對pH值變化不敏感,熒光強度受自發(fā)熒光干擾小。比較大激發(fā)光波長為550nm;比較大發(fā)射光波長為620nm,呈橙紅色熒光,與FITC發(fā)出的黃綠色熒光對比鮮明,常用于免疫熒光組織化學雙重染色。4、花青類染料常用的有Cy3、Cy5等,能與細胞內蛋白質結合。這類染料的熒光特性與傳統(tǒng)熒光素類似,但水溶性和對光穩(wěn)定性較強,熒光量子產率較高,對pH等環(huán)境不敏感。常用于多重染色。5、乙酸甲酯其本身不發(fā)熒光,但透膜進入細胞質后,在酯酶的作用下轉變?yōu)榫哂袩晒馓匦缘囊宜峒柞?。其激發(fā)光譜有pH依賴性,是使用**多的細胞內pH熒光指示劑。比較大激發(fā)光波長為505nm,比較大發(fā)射光波長為530nm,呈綠色熒光。 江蘇四色免疫組化分析服務
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使許多疑難**得到了明確診斷。在常規(guī)**病理診斷中,5%-10%的病例單靠。尤其是免疫組化在**診斷和鑒別診斷中的實用價值受到了普遍的認可,其在低分化或未分化**的鑒別診斷時,準確率可達50%-75%。免疫組織化學的臨床應用主要包括以下幾方面:⑴惡性**的診斷與鑒別診斷;⑵確定轉移性惡性**的原發(fā)部位;⑶對某類**進行進一步的病理分型;⑷軟組織**的***一般需根據正確的組織學分類,因其種類多、組織形態(tài)相像,有時難以區(qū)分其組織來源,應用多種標志進行免疫組化研究對軟組織**的診斷是不可缺少的;⑸發(fā)現微小轉移灶,有助于臨床***方案的確定,包括手術范圍的確定。⑹為臨床提供***方案的選擇。免疫組化免疫組化鏡檢在鏡檢前可以通過相關資料查詢抗體的表達部位:細胞間質、細胞膜、細胞漿、核膜、細胞核以及在其中的多個部位表達(如:MPO抗體表達在細胞膜、細胞漿、核膜、細胞核上)和表達組織(如:VWF抗體在血管壁上表達,呈現環(huán)形)。在顯微鏡下觀察時,先在4倍鏡下查找組織及其范圍,然后查看整個組織確定陽性產物的表達部位,然后將陽性產物表達部位置于視野正**,換高倍鏡觀察。江蘇多標記免疫組化染色服務
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