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產品關鍵詞:北京熒光定量PCR分析服務,熒光定量PCR
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詳細說明
熒光定量PCR 實驗步驟(1)
樣品RNA的抽提
①取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其完全溶解。
②每樣品加入1ml的TRIZOL試劑裂解,蓋緊管蓋,北京熒光定量PCR分析服務,北京熒光定量PCR分析服務。手動劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘,北京熒光定量PCR分析服務。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀?;靹蚝?,4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時,先加入無RNA酶的水40μl用移液器反復吹打幾次,使其完全溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 北京熒光定量PCR分析服務
實時熒光定量 PCR 分析優(yōu)化過程確實需要時間,但是所花的時間是值得的。這樣得出的分析結果不僅具有比較高的靈敏度和比較大的動態(tài)范圍,而且準確度高、效率高、重復性好,為實驗提供可靠的數(shù)據(jù)。
如果你的科研時間有限,也可以選擇朝瑞實時熒光定量PCR檢測服務,
擁有近10年的科研技術服務經歷,在生物技術服務方面有著多年的經驗積累和技術保障,訂購實時熒光定量PCR服務,還同時可享受**RNA提取(限動物組織樣本)、**逆轉錄及**的引物設計合成、**內參檢測等超值服務
北京熒光定量PCR分析服務
純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值范圍1.8到2.1。
變性瓊脂糖凝膠電泳測定
制膠
1g瓊脂糖溶于72ml水中,冷卻至60℃,10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
灌制凝膠板,預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽內,加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
準備RNA樣品
取3μgRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
電泳
上樣前凝膠須預電泳5min,隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h,電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。
紫外透射光下觀察并拍照
產生的 ΔRn 值也不同。請注意,熒光信號基線屬于非模板依賴性因素,兩種預混液的基線是不同的(圖 3A)。Ct 值的變化并沒有反映出反應系統(tǒng)的整體性能(圖 3B)。靈敏度相當?shù)念A混液產生的 Ct ***值可能不同。
使用預混液 A 和預混液 B 在等量的人類 gDNA 中進行 RNase P 擴增。(A) Rn 根據(jù)循環(huán)數(shù)進行繪制,并且顯示兩個反應的基線。(B) 對數(shù) (ΔRn) 根據(jù)循環(huán)數(shù)進行繪制。兩種預混液的閾值(綠線)設定為相同水平。對于相同濃度的靶標而言,預混液 B 的 Ct 值 (CtB) 早于預混液 A 的相應值 (CtA),表明預混液 B 的基線較低。使用 Applied Biosystems? 7500 實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)執(zhí)行所有擴增。
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質,可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染,將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn),即更高分子量的彌散遷移物質或者帶,RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結果。 ①反應體系 序號 反應物 劑量 1 逆轉錄buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆轉錄酶MMLV 0.5μl 6 DEPC水 5μl 7 RNA模版 2μl 8 總體積 10μl 輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。北京DNA甲基化熒光定量PCR實驗技術服務
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SYBR Green I法:SYBR Green I是一種具有綠色激發(fā)波長的染料,比較大吸收波長約為 497 nm,發(fā)射波長比較大約為 520 nm,可以和所有的 dsDNA 雙螺旋小溝區(qū)域結合。因為在游離狀態(tài)下 SYBR Green I 發(fā)出的熒光較弱,但是當它與雙鏈 DNA 結合后,熒光就會**增強,而且熒光信號的增加與 PCR 產物的增加完全同步。此法的優(yōu)點是它可以監(jiān)測任何 dsDNA 序列的擴增,檢測方法較為簡單,成本較低,但也正是由于熒光染料能和任何dsDNA 結合,如非特異性擴增產物和引物二聚體也能與染料結合而產生熒光信號,使實驗產生假陽性結果,因此其特異性不如探針法。因為非特異性產物和引物二聚體的變性溫度要比目標產物的低,所以可以在熔解曲線反應過程中利用軟件分析儀器收集到信號進行鑒別北京熒光定量PCR分析服務
上海朝瑞生物科技有限公司成立于2003-01-22,注冊資本:700-1000萬元。該公司服務型的公司。是一家有限責任公司企業(yè),隨著市場的發(fā)展和生產的需求,與多家企業(yè)合作研究,在原有產品的基礎上經過不斷改進,追求新型,在強化內部管理,完善結構調整的同時,優(yōu)良的質量、合理的價格、完善的服務,在業(yè)界受到***好評。公司目前擁有***員工5~10人人,具有[ "科研技術服務", "應用技術服務", "科研成果轉化", "科學產品銷售" ]等多項業(yè)務。上海朝瑞科技以創(chuàng)造***產品及服務的理念,打造高指標的服務,引導行業(yè)的發(fā)展。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/820232.html
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