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產(chǎn)品關(guān)鍵詞:江蘇臨床疾病熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),熒光定量PCR
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詳細說明
PCR 反應(yīng)的效率也會影響 Ct 值。在低效率條件下進行連續(xù)稀釋擴增,與高效率條件下相比,可能會產(chǎn)生斜率不同的標準曲線。在圖 5 中,兩個樣品(X 和 Y)分別在低效率和高效率條件下擴增,江蘇臨床疾病熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),在靶濃度相同的條件下得到了不同的 Ct 值。在此示例中,盡管高效率條件(圖 5 中的藍色曲線)在高濃度時產(chǎn)生的 Ct 值更晚,但它在靶濃度低時卻更為靈敏。PCR 效率取決于實驗、預(yù)混液性能和樣品質(zhì)量。通常情況下,反應(yīng)效率在 90-110% 之間都是可以接受的。另一方面,江蘇臨床疾病熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),假定所有其他因素如儀器、試劑和實驗完全相同, 該效率也有助于得出***個樣品的模板量更少的結(jié)論。然而,江蘇臨床疾病熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),如果產(chǎn)生兩個 Ct值使用的是不同的儀器、試劑、引物和探針或反應(yīng)體積,該結(jié)論就不成立。因此,只有在使用上文定義的相同反應(yīng)條件來比較實驗時,Ct ***值的比較才有意義。江蘇臨床疾病熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
實時熒光定量 PCR,又稱為定量 PCR 或 qPCR,可以為測定樣品中的靶標序列或基因數(shù)量提供簡單、簡潔的方法。該方法高度簡化,有時會忽略實現(xiàn)方法方面的關(guān)鍵因素,因此導(dǎo)致出現(xiàn)問題。本文將重點強調(diào)設(shè)置和評估實時熒光定量 PCR 反應(yīng)時必須考慮的這些因素。
江蘇臨床疾病熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,其中橫坐標**起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標**Ct值。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。同時,對于熒光PCR實驗來說,CT值也是判讀樣品陰陽性的重要指標。
大量的熒光定量PCR研究資料表明,病原體數(shù)量與***性疾病病情的輕重程度、傳染性及***效果均有相關(guān)性。因此,通過熒光定量PCR方法得到的檢測結(jié)果,一定程度上可以準確反映疾病***的情況。
混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘,取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致,然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl,37℃水浴60分鐘。
取出后立即95℃干浴3分鐘,得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液,保存于-80℃待用。 管家基因(β-actin)實時定量PCR
β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011,反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104,以備用。
反應(yīng)體系如下:
標準品反應(yīng)體系 序號 反應(yīng)物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 陽性模板上游引物F 0.5μl 3 陽性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 陽性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
熒光信號**擴增階段:只有在熒光產(chǎn)生進入**期, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,所以在PCR反應(yīng)處于**期的某一點上來檢測PCR產(chǎn)物的量,由此來推斷模板**初的含量而進行定量分析。研究表明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可得到標準曲線,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)
在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈**級的增加,所以反應(yīng)終產(chǎn)物量與起始模板量之間已經(jīng)不存在線性關(guān)系,通過反應(yīng)終產(chǎn)物也算不出起始DNA拷貝數(shù) 上海lncRNA熒光定量PCR分析服務(wù)
江蘇臨床疾病熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
無論 Ct ***值是多少,任何能夠有效擴增和檢測起始模板拷貝數(shù)為 1 的系統(tǒng)都達到了靈敏度的極限。
如前文所述,效率是決定反應(yīng)靈敏度的關(guān)鍵因素(圖 5)。在檢測極低拷貝數(shù)時的另一個重要的考慮因素是,不能預(yù)期模板為正態(tài)分布。相反,它會遵循泊松分布,該分布預(yù)測在平均包含一個拷貝的起始模板的大量重復(fù)中,實際上約 37% 不含拷貝,*有約 37% 含有 1 個拷貝,18% 應(yīng)包含 2 個拷貝(見圖 9)。因此,為了可靠地檢測低拷貝,必須做大量的重復(fù)實驗來提供統(tǒng)計***性,以克服泊松分布的限制。 江蘇臨床疾病熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
上海朝瑞生物科技有限公司創(chuàng)建于2003-01-22,注冊資金 700-1000萬元,是一家專注1.發(fā)布科研技術(shù) 2.發(fā)布應(yīng)用技術(shù) 3.發(fā)布專業(yè)專長 4.發(fā)布科研成果 5.發(fā)布我的需求 6.發(fā)布篩選檢驗檢測服務(wù) 7.發(fā)布協(xié)同代研發(fā)服務(wù) 8.發(fā)布升級改造產(chǎn)品服務(wù) 9.發(fā)布實驗室及儀器設(shè)備共享 10.發(fā)布培訓(xùn)基地共享 11.發(fā)布工廠代加工及共享車間 12.發(fā)布科研/項目團隊招聘13.發(fā)布研究生婚戀 14.發(fā)布項目整包服務(wù) 15.發(fā)布資源交換業(yè)務(wù)的公司。唯才是舉,唯能是用:擁有優(yōu)秀人才5~10人和,是實現(xiàn)企業(yè)戰(zhàn)略目標的基礎(chǔ),是企業(yè)持續(xù)發(fā)展的動力。上海朝瑞生物科技有限公司主營業(yè)務(wù)涵蓋[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ],堅持“質(zhì)量***、質(zhì)量服務(wù)、顧客滿意”的質(zhì)量方針,贏得廣大客戶的支持和信賴。目前公司已經(jīng)成為[ "科研技術(shù)服務(wù)", "應(yīng)用技術(shù)服務(wù)", "科研成果轉(zhuǎn)化", "科學(xué)產(chǎn)品銷售" ]的**企業(yè),正積蓄著更大的能量,向更廣闊的空間、更***的領(lǐng)域拓展。
文章來源地址: http://www.cdcfah.com/cp/854964.html
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